中华人民共和国国家标准
GB/T22963-2008
河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中玉米赤霉醇、 玉米赤霉酮、已烯雌酚、已烷雌酚、 双烯雌酚残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Determination of zearalanol zearalanone diethylstilbestrol hexestrol and dienoestrol residues in fugu.eels and baked eelLC-MS-MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.
本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口.
本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：许湿、吴延晖、何佳、张骏、张曼、林安清、庞国芳.
河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中玉米赤霉醇、 玉米赤霉酮、已烯雌酚、已烷雌酚、 双烯雌酚残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中玉米赤霉醇（zearalanol）、玉米赤霉酮（zearalanone）、已烯雌酚（diethylstilbestrol）、已烷雌酚（hexestrol）、双烯雌酚（dienoestrol）残留量液相色谱-中联质谱测定方法.
本标准用于河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定.
本标准的方法检出限：玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烷雌酚、已烯雌酚和双烯雌酚为1.0μg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 12004 ISO 5725-1; 1994 IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，1SO5725-2：1994，IDT)
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987.MOD）
3原理
用叔丁基甲基醚和乙酸盐缓冲液加酶解剂分别提取试样中残留的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚，经硅胶柱净化，用液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯.
4.2叔丁基甲基酸：色谱纯. 4.1水：GB/T6682，一级.4.3甲醇：色谱纯.4.4乙睛：色谱纯.4.5乙酸乙酯：色谱纯.4.6正已烷：色谱纯.4.8乙酸：优级纯. 4.7二氯甲烷：色谱纯.4.9乙酸钠（CHCOONa3H-O).4.10氢氧化钠：优级纯.
4.113mol/1氢氧化钠溶液：称取120g氢氧化钠（4.10）溶于1000mL去离子水中.4.120.2mol/L乙酸盐缓冲液（pH=5.2）：称取2.52g乙酸（4.8）和12.95g乙酸钠（4.9）溶解于800mL水中，用氢氧化钠溶液（4.11)调节pH值至5.2士0.1.加水定容至1000mL. 4.13溶解液：正已烷-二氧甲烷（32）.4.14淋洗液：乙酸乙酯-正已烷（347）.4.15洗脱液：乙酸乙酯-正已烷（32）.4.16-葡糖苷酸酶/硫酸酯复合酶：含p葡糖苷酸酶124400units/mL，硫酸酯酶3610units/mL.4.17激素及代谢物标准物质：玉米赤霉醇（包括.-玉米赤霉醇和玉米赤霉醇，各50%）纯度≥97%：4.18标准溶液：分别准确称取适量的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烯雌酚、双烯雌酚和己烷雌酚标准物 玉米赤霉酮，纯度≥97%；已烯雌酚，纯度≥99%：已烷雌酚，纯度≥98%；双烯雌酚，纯度≥98%.质，用甲醇（4.3）配制成1mg/mL标准贮备溶液.再根据需要以甲醇配制成不同浓度的混合标准溶液作为标准工作溶液，保存于4C冰箱中.4.19内标标准物质：a玉米赤霉烯醇-4氛代，纯度≥99%：已烯雌酚-8氛代，纯度≥98%.4.20内标标准溶液：准确称取适量α玉米赤霉烯醇-4尔代和己烯雌酚-8氛代标准物质，用甲醇（4.3） 分别配制成1mg/mL标准贮备溶液.再以甲醇稀释成适用浓度的混合内标工作溶液，保存于4C冰箱中.4.21基质提取液：空白样品，除不加人标准工作溶液（4.18）和内标标准工作溶液（4.20）外，其他同7.1.1~7.1.3处理后得到的溶液.以基质提取液（4.21）溶解，涡旋30s后即为基质标准工作溶液.4.23硅胶固相萃取柱：500mg.3mL.4.24滤膜；0.2ym.
5仪器
5.1液相色谱-串联质谱联用仪：配有电喷雾电离源.5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g.5.3自动固相萃取仪或固相萃取装置.5.4高速均质器：转速大于10000r/min5.5氮气吹干仪. 5.6烘箱：控温精度士1C.5.7涡旋振荡器.5.8离心机：转速大于3000r/min5.9pH计：测量精度士0.3pH单位5.10具塞离心管：25mL，50mL 5.11微量注射器：100gL.
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
做上标记. 取有代表性样品500g，绞碎后搅拌均匀，制成实验室样品.试样分为两份，置于样品盒中，密封，并
6.2试样保存
将试样于一18C下保存.
7测定步骤
7.1混合基质标准校准溶液的制备
7.1.1样品称取
称取5个阴性样品，每个样品为5g（精确到0.1g），将上述样品置于50mL离心管（5.10）中，分别加人适量混合标准工作溶液（4.18），使各被测组分玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烷雌酚、已烯雌酚和双烯雌酚的浓度分别为 2. 5ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL.再分别加人适量内标标准工作溶液（4.20），使其浓度均为10ng/mL.
7.1.2提取
全部转移至另一50mL具塞离心管（5.10）中备用.离心管中的残渣置于通风橱中挥发30min，加人 加人20mL叔丁基甲基醚（4.2），在10000r/min均质1min3000r/min离心5min，将上清液15mL乙酸盐缓冲液（4.12），高速均质1min，3000r/min离心5min，将上清液全部转移至另一25mL具塞试管（5.10）中，并在氮吹仪上于40C水浴中吹去残余叔丁基甲基醚后，加人80μLP葡糖苷酸酶（4.16）混匀，于52C烘箱中放置过夜.在此缓冲溶液中加入氢氧化钠溶液（4.11）将溶液pH值调至7，加人10mL叔丁基甲基醚，充分混合.3000r/min离心2min.移取叔丁基甲基醚层与前述的 叔丁基甲基醚提取液混合，在氨吹仪上于40C水浴中吹干.加人1mL溶解液（4.13），涡旋30s溶解，待净化.
7.1.3净化
固相萃取净化条件：用6mL正已烷分两次预洗硅胶柱（4.23），流速均为4mL/min，上样，流速为2mL/min，在样品试管中加人3mL淋洗液（4.14），混合后过柱，流速为2mL/min.用3mL淋洗液以 3mL/min的速度淋洗，加人2mL空气以4mL/min的速度吹过硅胶柱.用6mL洗脱液（4.15）洗脱，流速为2mL/min，加人2mL空气以6mL/min的速度吹过硅胶柱，收集洗脱液.将洗脱液在氮吹仪上于40C水浴中吹干，加入1mL流动相，涡旋30s溶解.溶液过0.2pm滤膜后，供液相色谱-串联质谱测定.
7.2实测样品溶液的制备
称取待测样品5g（精确到0.1g）于50mL离心管中，加人内标工作溶液，使其最终定容浓度均为10 ng/mL.按 7. 1.2和 7. 1.3操作.
7.3空白基质溶液的制备
称取阴性样品5g（精确到0.1g）于50mL离心管中，按7.1.2和7.1.3操作.
7.4测定条件
7.4.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：ZORBAX Eclipse SB-C8.3.5 μm，150 mm×4.6mm（内径）或相当者： b）柱温：25C；c）流动相：乙睛-水（73）；d）流速：0.5mL/min;e）进样量：50pl.
7.4.2质谱参考条件
b）扫描方式：负离子扫描； a）离子化方式：电喷雾电离；e）检测方式：多反应监测（MRM）：d）离子源温度：350C；
