中华人民共和国国家标准
GB/T 22964-2008
河豚鱼、鳗鱼中林可霉素、竹桃霉素、 红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、 吉他霉素、交沙霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Determination of linycin oleandomycin erythromycin tilmicosin，tylosin，spiramycin kitasamycin and josamycinresidues in fugu and eelLC-MS-MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口. 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局.本标准主要起草人：王飞、王海洋、曹彦忠、贾光群、张进杰、石玉秋、庞国芳.
河豚鱼、鳗鱼中林可霉素、竹桃霉素、 红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、 吉他霉素、交沙霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了河豚鱼和鳗鱼中林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素残留量的液相色谱-中联质谱测定方法.
本标准适用于河豚鱼和鳗鱼中林可霉素、竹桃毒素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他毒素和交沙霉素残留量的测定.
本标准的方法检出限：河豚鱼中的林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素均为2.Oμg/kg.鳗鱼中的林可霉素、红霉素、泰乐菌素、吉他霉素均为2.0pg/kg，螺旋霉素、竹桃霉素、交沙霉素、替米考星均为5.0pg/kg
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 1-2004 ISO 5725-1; 1994 IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，1SO5725-2：1994，IDT)
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987，MOD）
3原理
的残留用Tris缓冲溶液提取后，经OasisHLB固相萃取柱净化，甲醇洗脱，洗脱液浓缩定容后，液相色谱-中联质谱法测定，内标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯.4.1水：GB/T6682，一级.4.2甲醇：色谱纯.4.3乙酸铵.4.4乙睛：色谱纯. 4.5盐酸.4.6三羟甲基氨基甲烷（tris）：CHNO
11OasisHLB固相萃取柱是waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可.如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品.
4.7氯化钙：CaCI2HO4.8甲醇溶液：23.400mL甲醇（4.2）与600mL水混合.4.90.01mol/L乙酸铵溶液：0.77g乙酸铵（4.3）溶解于水中，定容于1000mL容量瓶中. 4.10定容液：0.01mol/L乙酸铵溶液（4.9）乙（4.4）（173）.4.11tris 溶液：称取12.0g三羟甲基氨基甲烷（4.6）、7.35g氯化钙（4.7）溶解于1000mL水中，用盐酸（4.5）调节pH值为9.4.12标准物质：林可霉素（CAS:7179-49-9）、竹桃霉素（CAS：7060-74-4）、红霉素（CAS：59319-72-1）、替米考星（CAS：108050-54-0）、泰乐菌素（CAS：74610-55-2）、螺旋霉素（CAS：8025-81-8）、吉他霉素 （CAS1392-21-8）、交沙霉素（CAS16846-24-5）和内标物质罗红霉素（CAS：80214-83-1)，纯度≥95%.4.13标准储备溶液I：1.0mg/mL，依次准确称取每种标准物质（4.12）适量，分别放人相应的10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀.4C保存.4.14标准储备溶液Ⅱl：10.0μg/mL.依次吸取0.1mL各标准储备溶液I（4.13），分别放人相应的4.15标准工作溶液：2.0μg/mL.依次吸取2.0mL混合标准储备溶液I（4.14）.分别放入相应的 10mL容量氟中.用甲醇定容至刻度.4C保存.10mL容量瓶中.用甲醇定容至刻度.4.16内标储备溶液：1.0mg/mL.准确称取10.0mg罗红霉素（4.12）于10mL容量瓶中，用甲醇溶4.17中间浓度内标溶液：10.0μg/mL.吸取0.1mL内标储备溶液（4.16）于10mL容量瓶中，用甲 解定容至刻度，混匀.4C保存.醇定容至刻度.4C保存.4.18内标工作溶液：1.0μg/mL.吸取1.0mL中间浓度内标标准溶液（4.17）于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度.
4.19基质标准混合工作溶液：
测定河豚鱼用基质标准混合工作落液：分别吸取1.0L2.0gL、5.OpL、25.0uL标准工作溶液（4.15），依次加人相应的试剂瓶中.再分别加人20.0uL内标工作溶液（4.18），用样品空白提取液定容至1.0mL.配成林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素分 0000溶液.
测定鳗鱼用基质标准混合工作溶液：分别吸取林可霉素、红霉素、泰乐菌素、吉他霉素各1.0gl、2.0gL、5.0μL、25.0μL标准工作溶液（4.15）和螺旋霉素、竹桃霉素、交沙霉素、替米考星各2.5pl、 5.0μL、10.0μL.25.0pL标准工作溶液（4.15），依次加人相应的试剂瓶中，再分别加人20.0pL内标工作溶液（4.18），用样品空白提取液定容至1.0mL.配成林可霉素、红霉素、泰乐菌素、吉他霉素分别为2.0ng/mL、4.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL和螺旋霉素、竹桃霉素、交沙霉素、替米考星分别为5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL的四个浓度水平的系列基质标准混合工作 溶液.
4.20OasisHLB固相萃取柱：500mg.6mL.或相当者.使用前.先后用10mL甲醇和10mL水活化，在抽真空前的各步骤中，都保持柱体湿润.
4.21滤膜：0.2 ym.
5仪器
5.1液相色谱-中联质谱仪：配有电喷雾离子源.5.2天平：感量0.01g，0 0001g.5.3固相萃取装置， 5.4氮气浓缩仪.5.5具塞聚丙烯离心管：50ml.2
5.6离心机：20000g离心力（或相当于12000r/min）.5.7超声波清洗仪.5.9振荡器. 5.8pH计.
6试样制备与保存
6.1试样的制备
从全部样品中取出有代表性样品约1kg，充分搅碎，混匀，均分成两份，分别装入洁净容器内.密封后作为试样，标明标记.在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化.
6.2试样的保存
将试样于-18C保存.
7测定步骤
7.1提取
10.0mL tris溶液（4.11)，于振荡器上剧烈振荡10min.以 12 000 r/min 转速离心 10min，取上清液以小于1.0mL/min的流速通过OasisHLB固相萃取柱（4.20）.再加人10.0mL tris溶液（4.11)，于振荡器上剧烈振荡10min.以12000r/min转速离心10min，取上清液以小于1mL/min的流速通过 Oasis HLB 固相萃取柱.
7.2净化
待样液全部流出后，先后用10mL水和10mL甲醇溶液（4.8）洗柱，弃去全部流出液，将固相萃取柱用真空泵抽干1h.再用10mL甲醇（4.2）洗脱于15mL氮吹管中，用氮气浓缩仪于50C水浴中吹备空白样品提取液.过0.2μm滤膜（4.21）后，供液相色谱-串联质谱仪测定. 至近干，准确加人1.0mL定容液（4.10），于超声波仪中超声波助溶残渣.用阴性样品，按上述步骤制
按上述操作步骤，制备用于配制系列基质标准工作溶液的空白样品提取液.
7.3测定条件
7.3.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：Atlantis C内径3μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者；b）流动相A：乙睛；c）流动相B：0.1%甲酸水溶液；d）流动相C：甲醇： e）梯度洗脱条件：见表1；f）流速：0.2ml/min;g）柱温：30C：h）进样量：20pl.
表1梯度洗脱条件
时网/min A/% B/% c/%0 00 90 0 5 0 5.05 00 5 0 90 0 5.09 00 5.0 90 0 5.09 10 90 0 5 0 5.017.0 90 0 5 0 5.0
