中华人民共和国国家标准
GB/T 22985-2008
牛奶和奶粉中恩诺沙星、达氟沙星、 环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、 二氟沙星和麻保沙星残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Determination of enrofloxacin，danofloxacin，ciprofloxacin sarafloxacin orbifloxacin difloxacin and marbofloxacin in milk and milk powder-LC-MS-MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口.疫局.本标准主要起草人：陈瑞春、吕红英、段文仲、郭春海、艾连峰、邢军、马育松、姚春毅、庞国芳.
牛奶和奶粉中恩诺沙星、达氟沙星、 环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、 二氟沙星和麻保沙星残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了牛奶和奶粉中恩诺沙星、达氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、二氟沙星和麻保沙星残留量液相色谱-串联质谱测定方法.
本标准适用于牛奶和奶粉中恩诺沙星、达氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、二氟沙星和麻保沙星残留量的测定和确证.
本标准的方法检出限：牛奶中恩诺沙星、达氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、二氟沙星和麻保沙星均为1μg/kg：奶粉中恩诺沙星、达氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、二氟沙星和麻保沙星均为4 yμg/kg
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
(GB/T 6379. 1-2004 1SO 5725-1;1994 IDT) GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT）
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987，MOD)
3原理
用乙睛和磷酸盐缓冲溶液提取试样中残留的恩诺沙星、达氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、二氟沙星和麻保沙星，OasisHLB固相萃取柱”净化，5%氨水甲醇溶液洗脱，液相色谱-中联质谱测定，外标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：色谱纯.4.2乙睛：色谱纯. 4.3磷酸：色谱纯.4.4甲酸：色谱纯.
GB/T 22985-2008
4.5磷酸氢二钠，NaHPO12HO4.6磷酸二氢钾，KHPO（9）91（）89（0）8 4.7氨水.1000mL烧杯中，加人800mL水溶解，用磷酸（4.3）调至pH=3.0.再用水定容至1000ml.4.95%氨水甲醇溶液：吸取50mL氨水（4.7）与950mL甲醇（4.1）混合.4.10甲酸溶液（pH=3.0）：量取500mL水，用甲酸（4.4）调pH值到3.0. 4.1125%甲醇溶液：量取250mL甲醇（4.1）用水稀释到1000mL.4.12甲醇-甲酸溶液（1585）：量取30mL甲醇（4.1）与170mL甲酸溶液（4.10）混合.4.13标准物质：恩诺沙星、达氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、二氟沙星、麻保沙星标准物质，纯4.14标准储备溶液：0.1mg/ml.准确称取适量的每种标准物质，用甲醇（4.1)配成0.1mg/mL的 度大于等于95%.标准储备溶液，该溶液在4C保存.4.15混合标准中间溶液：1μg/mL.分别吸取1ml.标准储备溶液（4.14）放入100mL容量瓶中，用4.16混合标准工作溶液：根据需要用空白样品提取液配不同浓度的混合标准工作溶液，混合标准工 甲醇（4.1）定容至刻度.该溶液在4C保存.作溶液在4C保存.4.17Oasis HLB固相萃取柱或相当者：60mg，3mL.使用前分别用5mL甲醇和5mL水和5mL磷酸盐缓冲溶液（4.8）活化，保持柱体湿润.4.18滤膜；0.2 ym.
5仪器和设备
5.1液相色谱-中联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源.5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g. 5.3涡旋振荡器.5.4固相萃取装置.5.5氮气吹干仪.5.6真空系：最大负压80kPa.5.7pH计：测量精度士0.02pH单位. 5.8贮液器：通过转接头连接于OasisHLB固相萃取柱上.5.9离心机5.10旋转蒸发仪.5.11具刻度离心管：10mL.
6试样的制备与保存
6.1试样的制备6.2试样保存 将牛奶从冰箱中取出，放置至室温摇匀，备用.牛奶置于4C冰箱中避光保存，奶粉常温避光保存.
7测定步骤
7.1提取 7.1.1牛奶称取2g试样，精确到0.01g，置于50mL具塞塑料离心管中，加人10mL乙睛，于涡旋振荡器振2
荡提取1min，5000r/min离心5min，上清液过滤到鸡心瓶中，在残渣中加入5mL磷酸盐缓冲溶液（4.8），10mL乙晴，重复以上步骤，合并上清液，于50C旋转蒸发，至乙晴全部蒸出.加人5mL磷酸盐缓冲溶液，混匀.
7.1.2奶粉
称取0.5g试样，精确到0.01g，置于50mL具塞塑料离心管中，加人6mL磷酸盐缓冲溶液（4.8），涡旋混匀，再加人10mL乙睛，于误旋振荡器振荡提取1min，5000r/min离心5min，上清液过滤到鸡心瓶中，在残渣中加人5mL磷酸盐缓冲溶液，10mL乙睛，重复以上步骤，合并上清液，于50C 旋转蒸发，至乙晴全部蒸出.加人5mL.磷酸盐缓冲溶液，混匀.
7.2净化
将7.1的样液转移到贮液器中，再用5mL磷酸盐缓冲溶液洗鸡心瓶，洗液合并到贮液器，以约1 mL/min的流速全部过HLB固相萃取小柱（4.17)，待样液完全流出后，先后以4mL水、4mL25%甲氮气吹至约0.2mL时停止浓缩，用甲醇-甲酸溶液（4.12）定容至1mL，5000r/min离心5min.过0.2um滤膜，供液相色谱中联质谱分析.
7.3空白基质溶液的制备
将取牛奶阴性样品2g，奶粉阴性样品0.5g.按7.1和7.2操作.
7.4测定条件
7.4.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
a）色谱柱：C5pm，150mm×2.1mm（内径）或相当者；c）进样量：15L b）色谱柱温度：30C；d）流动相梯度及流速见表1.
表1液相色谱梯度洗脱条件
时间/min 滤速/(gL/min 0.1%乙酸水溶液/% 甲醉/%0 00 200 80 205 00 200 40 609 00 200 40 6011 00 9 10 200 80 20200 80 20
7.4.2质谱参考条件
质谱参考条件如下：
b）质谱扫描方式：多反应监测（MRM）：c）鞘气压力：104kPa； d）辅助气压力：138kPa;e）正离子模式电喷雾电压（IS）：4000V；毛细管温度：320C；g）源内诱导解离电压：10V； h）Q1，Q3分辨率：Q1为0.4，Q3为0.7；i）碰撞气：高纯氢气；j）碰撞气压力：0.2Pa；
a）离子化模式：电喷雾正离子模式（ES1十）：
