中华人民共和国国家标准
GB/T22986-2008
Determination of prednisolone residues in milk and milk powderLC-MS-MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口.
本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局、内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司.
牛奶和奶粉中氢化泼尼松残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了牛奶和奶粉中氢化泼尼松残留量的液相色谱-中联质谱测定方法.本标准适用于牛奶和奶粉中氢化泼尼松残留量的测定.本标准方法检出限：牛奶为0.5μg/kg.奶粉为4.0μg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义（GB/T6379.1一2004 ISO 5725-1;1994 IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT)
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987，MOD)
3方法原理
试样中的氢化波尼松用甲醇-乙酸缓冲溶液提取，正已烷除脂，固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量，选择离子定性.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：色谱纯.4.2甲酸：色谱纯.4.3正已烷：色谱纯. 4.4冰乙酸.4.5三水乙酸钠.4.60.2mol/L乙酸溶液：吸取5.72mL冰乙酸（4.4）至500mL容量瓶中，用水定容至刻度.4.70.2mol/L乙酸钠溶液：称取27.22g三水乙酸钠（4.5），用水溶解后转移至1000mL容量瓶中，水定容至刻度.调节溶液的pH=5.2.4.930%甲醇水溶液：量取30mL甲醇（4.1），用水稀释定容至100ml.4.10甲醇饱和正己烷：量取甲醇（4.1)10mL置于分液漏斗中，加正已烷（4.3）90mL，振荡混合4.11氢化凌尼松标准品：纯度大于99%. 1min，静置分层后，取上层液备用.
储备溶液，于-18C避光储存.4.13氢化凌尼松标准工作溶液：根据需要吸取适量的氢化泼尼松标准储备溶液（4.12），用甲醇（4.1）4.14氢化凌尼松基质标准工作溶液：根据需要吸取适量的氢化泼尼松标准工作溶液（4.13），用阴性样 逐级稀释成适当浓度的标准工作溶液，于一18C避光储存.品提取液稀释配制成浓度范围为0.50ng/mL~100ng/mL的系列基质标准工作溶液，该溶液应现用现配.4.15固相萃取柱：OasisHLB柱或性能相当者.500mg、6mL.使用前用5mL甲醇（4.1)和5mL水进行活化.
4.16滤膜；0. 2 μm
5仪器和设备
5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）.5.2分析天平：感量0.01mg和0.01g. 5.3固相萃取真空装置，5.4均质器.5.5旋转蒸发器.5.6离心机.5.7微量注射器：50l. 5.8氮气吹干仪.5.9旋涡混合器.
6试样的制备与保存
6.1.1牛奶：取有代表性试样约500g，搅拌均匀后装入洁净容器内密封并做好标识. 6.1.2奶粉：取有代表性试样约500g，搅拌均匀后装入洁净容器内密封并做好标识.准确称取12g乳粉试样（精确到0.01g）于250mL烧杯中，少量多次加人50mL煮沸并冷却到60C左右的水溶解，冷却至室温后，移人100mL容量瓶中，用少量水分次潜洗烧杯，淋洗液一并移人容量瓶，再用水定容到刻度，混匀，制备成奶粉复原乳试样.
6.2试样的保存
将试样于4C保存.
7测定步骤
7.1提取
中，依次加人10mL乙酸缓冲溶液（4.8）、15mL甲醇（4.1）和10mL甲醇饱和正已烷（4.10）.用均质器 准确称取5g牛奶试样（精确到0.01g）或量取5.00mL奶粉复原乳试样（6.1.2）于50mL离心管以15000r/min提取1min.并用约2mL甲醇（4.1）淋洗均质器，用离心机在4C以10000r/min离心10min，弃去上层正已烷层，清液转人鸡心瓶中，在40C下旋转蒸发至体积小于10mL，待净化.
7.2净化
水、3mL30%的甲醇水溶液（4.9）和5mL正已烷（4.3）淋洗固相萃取柱，弃去全部淋洗液.减压抽干 将上述浓缩液以小于等于3mL/min的速度通过预先活化好的固相萃取柱（4.15），依次用5mL1min，然后用6mL甲醇（4.1）洗脱.洗脱液在低于40C氮气吹干至体积小于2mL.用甲醇（4.1）定容至2.00mL，混匀后，过0.2gm有机相滤膜（4.16），供液相色谱-串联质谱仪测定.
7.3阴性样品提取液的制备
取不含氢化泼尼松的阴性牛奶或者奶粉样品，按7.1和7.2步骤制备阴性样品提取液，用于配制氢化凌尼松基质标准工作溶液.
7.4测定条件
7.4.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
b）柱温：35C； a）色谱柱：Acquity UPLCTBEH Cl，1. 7 μm，100mm×2. 1 mm（内径）或相当者：进样量：5Ld）流动相及流速见表1. c)
表1液相色谱梯度洗脱条件
时间/min 流速/(mlL/min) 水（含0.1%的甲酸1/% 甲醉/%0 00 0 3 90 103 00 0 3 10 905 00 0 3 10 906 00 8 00 0 3 0 3 90 90 10 10
7.4.2质谱参考条件
质谱参考条件如下：
a) 离子源：电喷雾离子源（ESI）：扫描方式：负离子扫描；c) d) 检测方式：多反应监测（MRM）； 锥孔电压：23V；e) 毛细管电压：3.00kV；) 离子源温度：110C；g） 脱溶剂气温度：400C：h) i） 脱溶剂气流：400L/h： 锥孔气流量：50L/h；j）碰撞气压力：0.36 Pa；k）碰撞气：氨气：1）氢化泼尼松定性离子对、定量离子对、碰撞能量及驻留时间见表2.
表2氢化泼尼松定量离子对、定性离子对、碰撞能量及驻留时间
定量离子对（m/z) 定性离子对（m/=） 405 4/329 5 碰殖能量/eV 23 驻留时间/s 0 05405 4/329 5 405 4/359 6 15 0 05
7.4.3液相色谱-串联质谱测定
7.4.3.1定性测定
在相同的实验条件下进行样品测定时，如果样品中待测物质的色谱峰保留时间与标准品色谱峰保
1）Acquity UPLCT BEH C是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可.如果其他产品具有租同的效果，则可使用这些等效产品.
