中华人民共和国国家标准
GB/T22991-2008
Determination of virginiamycin residue in bovine milk and milk powderLC-MS-MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局，中华人民共和国辽宁出人境检验检 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口.疫局.本标准主要起草人：宋文斌、李一尘、董振霖、隋凯、赵景红、薛大芳、张华一、李振荣、庞国芳.
牛奶和奶粉中维吉尼霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了原料乳和纯奶粉中维吉尼霉素M1（virginiamycinM1）残留量测定的液相色谱-串联质谱测定方法.
本标准适用于原料乳和纯奶粉中维吉尼霉素M1残留量的测定.
本标准的方法检出限：原料乳中维吉尼霉素M1为0.25μg/L，纯奶粉中维吉尼霉素M1为2.0pg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义（GB/T6379.1一2004 1SO 5725-1:1994 IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.22004，ISO5725-2：1994，IDT)
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987 MOD)
3原理
试样中残留的维吉尼霉素M1在甲醇十乙晴混合提取液中涡旋提取、离心、取上清液用磷酸二氢铵缓冲溶液稀释，于C固相萃取柱进行净化.将洗脱液中的维吉尼霉素M1用三氯甲烷分离萃取，去除 水层，氮吹三氯甲烷至干，用甲酸铵缓冲溶液与甲醇混合液溶解并定容，供液相色谱-中联质谱仪测定.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1乙酸. 4.2甲酸：色谱纯.4.3甲醇：色谱纯.4.4乙晴：色谱纯.4.5三氯甲烷：色谱纯.4.6磷酸二氢铵：优级纯. 4.7甲酸铵：优级纯.4.8磷酸二氢铵溶液：0.1mol/1，称取11.50g磷酸二氢铵（4.6）.用水溶解定容至1000mL.4.9磷酸二氢铵溶液：0.01mol/L，量取0.1mol/L磷酸二氢铵溶液（4.8）100mL，用水稀释定容至1 000 mL.4.10甲酸铵缓冲液：0.12mol/L，pH=3.2.称取7.56g甲酸铵（4.7）.用水溶解，用甲酸（4.2）调节 pH到3.2.定容至1000mL.4.11甲酸铵缓冲液：0.003mol/L.pH=3.2，量取25.0mL的甲酸铵缓冲液（4.10)，用水稀释定容至
1 000 mL 4.12甲醇乙晴溶液（11)：4.14水甲醇溶液（137）. 4.13水乙晴溶液（41）.4.15水甲醇溶液（911).4.16流动相A;0.003mol/L甲酸铵缓冲液（4.11)用0.2m滤膜过滤.流动相B：甲醇乙晴溶液（11）（4.12）用0.2μm滤膜过滤，4.18标准储备溶液：0.1mg/mL.准确称取适量的维吉尼霉素M1标准物质，用甲醇配成0.1mg/mL 4.17标准物质：维吉尼霉素M1（CAS：21411-53-0），纯度95%.的标准储备溶液.该溶液在4C保存.注：称取标准物的质量是按纯度修正过的质量.4.19标准工作溶液：根据维吉尼霉素M1的灵敏度和仪器线性范围，用空白样品提取液配成不同浓度的标准工作溶液.标准工作溶液在4C保存.
5仪器
5.1液相色谱-中联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源.5.2离心机：最大转速为10000r/min.5.4电子天平：感量0.1mg和0.1g. 5.3离心管：锥形底玻璃离心管40mL.15mL和10mL，具塞；锥形底聚丙烯离心管50mL具螺旋盖.5.5过滤器：聚四氟乙烯膜过滤器：0.22μm×13mm：尼龙膜过滤器：0.22pm×47mm.5.6移液器：量程为1mL~10mL和5mL~50mL.5.7微量加液器：量程为10 yL~100yL，100pL~1 000xL5.8流动相过滤装置.5.9氮气浓缩仪. 5.10高速涡流混合器.5.11振荡器.5.12酸度计：精确度为土0.02.5.13超声波仪，5.14一次性注射器：1mL. 5.15固相萃取柱：Bond Elut Ci500mg，柱长为6mL.5.16鸡心瓶：150mL5.17贮液器：100mL.5.18试样瓶：2mL.5.19一次性移液管. 5.20滤纸.
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
将原料乳和纯奶粉样品分别混合均匀.各自分出0.5kg作为试样，将分出的试样密封，并作上标记
6.2试样保存
将试样置于4C条件下贮存.
7测定步骤
7.1提取
7.1.1原料乳样品
称取原料乳5.00mL，精确到0.01mL，放入50mL聚丙烯离心管中，加人10mL的甲醇乙晴溶液（11）误旋1min，高速振荡10min，离心15min（5000r/min），将上清液转移至40mL离心管中.再向残渣中加人2mL甲醇乙溶液（11）祸旋5s，高速振荡5min-在5000r/min下离心10min. 合并两次上清液与40mL离心管中.加人15mL的0.01mol/L磷酸二氢铵溶液（4.9），高速振荡5min，以5000r/min离心10min，用滤纸过滤至150mL的鸡心瓶中，加入80mL磷酸二氢铵缓冲液（4.9）混匀待净化.
7.1.2纯奶粉样品
称取纯奶粉0.625g.精确到0.001g，放人50mL聚丙烯离心管中加水4.375g，超声溶解得到复原乳.加入10mL的甲醇乙晴溶液（11）误旋1min.以下步骤同原料乳样品.
7.2净化
贮液器（5.17），将样液（7.1）过柱，移去贮液器（5.17）.依次用2mL水，10mL水乙晴溶液（41）， 依次用5mL乙腊、5mL水和5mL的磷酸二氢铵（4.9）洗涤活化固相萃取柱（5.15）.在柱上装上2mL水和10mL水甲醇溶液（137）洗柱，弃去全部流出液.最后用5mL水甲醇溶液（911）洗涤维吉尼霉素M1，收集洗脱液到15mL的玻璃离心管中.将10mL三氯甲烷（4.5）加人洗脱液中，振荡5min，离心10min（5000r/min）.用一次性移液管定量收集三氯甲烷层到10mL离心管中，在 40C条件下氮吹至干.再向离心管中加人500L甲醇，超声5min，加人500uL甲酸铵缓冲液（4.11)，高速涡旋5s.样液用0.2pm的滤膜过滤到样品系中，供液相色谱-串联质谱仪测定.
7.3色谱测定
7.3.1液相色谱条件
液相色谱条件如下：
a）色谱柱：SunFireC，5μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者；b）柱温：40C;c）进样量：30pL；d）色谱柱总流量：300guL/min; e）流动相及梯度见表1.
表1流动相及梯度
时间/min 流动相A/% 流动相 B/%0 00 93 720 00 40 6026 00 40 6028 00 86 735. 00 93 7
7.3.2质谱条件
质谱条件如下：
a）离子源：电喷雾离子源：b）扫描方式：正离子扫描；c）检测方式：多反应检测； d）电喷雾电压（1S）：5000V；e)雾化气压力（CAS1);517.1kPa；
