中华人民共和国国家标准
GB/T 23239-2009
Diagnostic techniques for Trypanosomosis evansi
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的制定参照了世界动物卫生组织（OIE）编写的《陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽鸟与蜜蜂））（第五版，2004）.
本标准的附录A、附录B和附录C为资料性附录.
本标准由中华人民共和国农业部提出.
本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口.
本标准起草单位：中国农业科学院上海兽医研究所.
本标准主要起草人：周金林、沈杰.
伊氏锥虫病诊断技术
1范围
本标准规定了新鲜血片、薄血涂片染色、毛细管集虫、实验动物接种等病原鉴定方法和乳胶凝集试验、间接血凝试验和酶联免疫吸附试验等血清学试验技术.
本标准适用于伊氏锥虫病的诊断、检疫、流行病学调查.
2临床诊断
依家畜种类不同，临床症状表现不同.马（骤、驴）一般呈急性经过，感染后，体温突然升高到40C以上，稽留数日，而后经短时间的间隙，再行发作，体表水肿为常见症状，结膜和第三眼脸常有出血斑. 黄牛、水牛及骆驼等一般呈慢性经过，有不定期的间歇发热，食欲不振，消瘦，肿脚和耳、尾干枯症状，许多慢性感染病例无明显病变.
有以上临床症状者，可以怀疑感染，确诊需要实验室检验.
3病原鉴定
3.1采血样
可从耳静脉或尾静脉采取外周血，从颈静脉或其他大静脉采取深部血液，因伊氏锥虫喜欢寄生于深部血液，处于低虫血症时，外周血检出率常低于深部血的50%.
3.2新鲜血片检查
在干净载玻片上滴上一小滴鲜血，盖上盖玻片，使血液扩散成为细胞单层，再用光学显微镜（200倍）观察活动锥虫.为防止血液在观察时干涸，也可先在载玻片滴血时加一滴生理盐水或3%柠檬酸三钠生理盐水.
3.3薄血膜染色检查
将一小滴血放在清洁载玻片一端约20mm处，按常用方法推成薄血膜，迅速风干，用甲醇固定2min，干燥后，再加姬氏染色液（配法参见附录A）染色25min，倾去染色液，自来水冲洗，干燥后用400倍~1000倍显微镜检查.
3.4毛细管集虫检查
3.4.1材料准备
肝素处理过的毛细管（管内径1.5mm，长75mm的玻璃或无色透明的硬质塑料管，在拟进血的一编吸人3%肝素钠10mm，用烤箱70C～80C烤干后备用），显微镜一台，离心机一台，载玻片，盖玻 片，12号以上注射针头（或金属针），塑泥（橡皮泥）.
3.4.2采集待检血样
从动物耳静脉或尾静脉穿刺获得血液.先用酒精棉擦净拟采血处皮肤，干后用针头穿刺血管，血流出时用毛细管吸人达40mm深（即70pL血）封闭未沾染血的另一端（可用塑泥或火焰加热封闭）.
3.4.3集虫
以3000g离心10min，待红细胞全部沉积于毛细管下半部，上层为黄色血浆时即可.
3.4.4检查
在毛细管的血浆与红细胞分界线下1mm处将管折断（切断、剪断），将带有少量红细胞的血浆滴于如需进一步详细观察虫体，可再除去盖玻片，晾干血片后，用姬氏染色液染色后，在800倍～1500倍放 载玻片上，盖上盖玻片，使血液扩散成细胞单层.在350倍～400倍放大的光学显微镜下检查活锥虫，大的显微镜下观察确定.
3.5动物接种
采被检动物血0.25mL，加入灭菌阿氏液（或3%柠橡酸三钠生理盐水）0.25mL，经腹腔注射入小性，可用环磷酰胺或醋酸氢化可的松抑制小白鼠的免疫力. 白鼠（大白鼠则加倍量），每周3次从尾部采血检查活寄生虫，为提高锥虫在小鼠体内培养繁殖的敏感
4血清学试验
4.1乳胶凝集试验
4.1.1材料准备
4.1.1.1器材：乳胶凝集试验反应板，为具黑色背景的玻璃板，用漆或油性色笔将板面分成（20mm~30mm）×（20mm~30mm）的方格若干个.25μL移液器（或5μL~200μL可调移液器）或滴管.具凹井的有机玻璃（或玻璃）血凝反应板.
4.1.1.2试剂：化学交联锥虫抗原的乳胶诊断液锥虫病阳性血清和阴性血清，生理盐水.
4.1.2分析步骤
4.1.2.1用移液器或滴管将生理盐水对被检血清、阳性血清和阴性血清作1：40稀释.4.1.2.3在各方格血清中分别加入同样量的乳胶诊断液，轻轻摇匀，8min内观察结果，室温低于 4.1.2.2用滴管在乳胶凝集试验反应板上各方格中分别滴人已被稀释的血清一滴.10 C时需延长 2 min~3 min 观察，高于 30 C时需提前2 min~3 min观察.
4.1.3结果判定
反应液由均匀白色改变为整个液体清亮，并有细小白色凝集颗粒分散其中者为阳性，如仍为均匀白重做. 色则为阴性.如阳性血清未出现阳性反应，或阴性血清出现阳性反应属操作有误或器材准备不合格，需
4.2间接血凝试验
4.2.1材料准备
4.2.1.1器材：V形（90角）微量血凝板，10pL、50pL及100L移液器，温箱.4.2.1.2试剂：锥虫病间接血凝诊断液，包含抗原致敏血球悬液和非致敏血球悬液：阳性血清或阳性干
燥血纸：磷酸缓冲液（PBS配法参见附录B）.
4.2.2分析步骤
4.2.2.1先在血凝板写上血清或血纸编号，每份血清取2排各6个孔，上排作测定排，下排为对照排.
4.2.2.2于左边每上排第1孔内加缓冲液200gL和血清50μL（5倍稀释），如用血纸则剪取1.2cm²液50μL.
4.2.2.3从第1孔内吸取已稀释的血清或血纸浸出液50uL加人第2孔内，再向右按次序作倍比稀释，共稀释到160倍（血清）或640倍（血纸）.并吸取第1孔内液50uL加人第2排第2孔内，按同样方法向右作倍比稀释.最后孔中吸取50uL稀释液丢弃.
4.2.2.4向测定排第2孔至第6孔中各加入致敏血球悬液10L.向对照排第2孔至第6孔中各加人非致墩血球悬液10pL（如表1）.
表1
血清稀释倍数血清号 5 10 20 40 08 160 320 640定1 对照2 测定对照
表1（续）
血清号 血清稀释倍数5 10 20 40 80 160 320 6403 测定对照4 测定测定 对照5 对照测定 阴性血清阴性直清6 对照 缓冲液 缓冲液
4.2.2.5阳性血清也按上述方法操作，另设仅加缓冲液50pL的空白对照孔2个，分别加人致缴和非致敏血球悬液10uL
4.2.2.6用微型血凝板振荡器或手指轻拍，将血液悬液与血清稀释液混匀.置于26C～30C条件下 1h~2h有一小红色圆点，周围为淡红色毛玻璃状，为阳性，记录为"”.红血球大部分沉于孔底中沉于孔底中央，图像为孔底中央有一大的红色圆点，周围液体清亮，无淡红色，为阴性，记录为”一”.
4.2.3结果判定
对照排高出2个稀释度或更多时，该份被检血清判为阳性，仅高出一个稀释度判为可疑.测定排与对照 凡测定排阳性反应孔不到1：80稀释时判为阴性，1：80稀释孔及其以上为阳性反应，且测定排比排阳性反应孔稀释度相同者判为阴性.
4.2.4注意事项
4.2.4.1诊断液用时要充分摇匀.4.2.4.2如到最高稀释度测定排与对照排都是阳性反应时，则应再连续稀释下去.一直稀释到 第12孔为止.
4.2.4.3血纸勿被蝇等昆虫爬，未干时也不能重叠.
4.3酶联免疫吸附试验（ELISA）
4.3.1材料准备
200L移液器）
4.3.1.2试剂：锥虫可溶性抗原、辣根过氧化物酶标记的兔抗牛1gG抗体、牛血清白蛋白、参考阴性血清、阳性血清、pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH7.4的PBS-吐温缓冲液、pH5.0的柠檬酸盐缓冲液（以上3种缓冲液配方参见附录C）、邻苯二胺、30%HO、2mol/LHSO.
4.3.2分析步骤
人200L 置于2C~10C冰箱中20h~24h
4.3.2.2倒去抗原液，用PBS-吐温缓冲液洗涤3次，每次5min，甩干.用PBS-吐温缓冲液溶解牛血清白蛋白至1g/20mL，向各孔中加人250L，置37C湿盒内1h.
4.3.2.3倒去白蛋白液，同上方法洗涤，甩干.将阴性、阳性血清和被检血清均用PBS液作1：200稀释，各孔中分别加人200μL，每份血清同样加入2个孔.另设空白对照孔2个，只加PBS液.置37C
