中华人民共和国国家标准
GB/T23741-2009
Determination of fourkindsofbarbiturates in feeds
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A为资料性附录.本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口. 本标准主要起草单位：农业部饲料质量监督检验测试中心（济南）.本标准主要起草人：李俊玲、李会荣、强莉、刘继明、门晓冬、李宏、杨志强.
饲料中4种巴比妥类药物的测定
1范围
本标准规定了饲料中巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥的高效液相色谱测定方法和液相色谱-中联质谱测定法.
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和漆加剂预混合饲料中4种巴比妥类药物的测定.高效液相色谱测定方法定量限为1mg/kg，液相色谱-中联质谱方法定量限为0.05mg/kg.
2规范性引用文件
的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987，MOD）GB/T14699.1饲料采样（GB/T14699.1-2005，1SO6497:2002IDT)GB/T20195动物饲料试样的制备（GB/T20195-2006 ISO6498:1998 IDT)
3方法原理
试样中的4种巴比妥类药物用三氯甲烷提取，过滤，滤液吹干后溶解过固相萃取小柱净化，洗脱液定量.
4试剂和材料
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，实验室用水符合GB/T6682一级水的规定.
4.2乙晴：色谱纯. 4.1甲醇：色谱纯.4.3三氯甲烷.4.4二氯甲烷.4.6甲醇水溶液：11.4.7乙晴水溶液：3070.4.8磷酸盐缓冲液：c（NaHPO NaHPO2HO)=0.1mmol/L pH=6.0.称取 14.2g的无水磷酸氢二钠（Na:HPO），加水定容至1000mL，摇匀：另称取15.6g的磷酸二氢钠（NaH-PO2HO），加水定容至1000mL，摇匀.取上述两种溶液按123877的比例混匀即可. 4.9流动相：甲醇水=4555.4.10巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥标准品：纯度≥99.0%.4.11标准贮备液：准确称取巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥标准品各25mg，分别用甲醇4.12混合标准中间液：准确移取巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥贮备液（4.11）各5mL， （4.1）溶解，定容至25mL，配成浓度为1mg/mL的标准贮备液.2C~8C冷藏保存，有效期三个月.用甲醇（4.1）定容至50mL，该混合溶液中巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥的浓度均为
4.52%甲醇水溶液：取2mL甲醇与98mL水混合.
100pg/mL，2C~8C冷藏保存，有效期一个月.
GB/T 23741-2009
4.13固相萃取小柱：亲水亲脂平衡固相萃取柱，3mL（60mg）.4.14滤膜；0.22μm
4.15滤纸：快速，12.5cm.
5仪器和设备
5.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器.5.2液相色谱-中联质谱仪：配电喷雾离子源.5.3天平：感量为0.0001g. 5.4氮吹仪.5.5涡旋振荡器.5.6固相萃取仪.
6试样制备
按GB/T14699.1采样.选取有代表性饲料样品至少500g，按GB/T20195规定，制备通过0.45mm实验筛的试样.
7试样处理
7.1提取
称取试料2g（精确至0.0001g）于100mL离心管中，准确加人25mL三氯甲烷（4.3），涡旋振荡2min，过滤.准确移取滤液15mL于具塞试管中，40C氮吹至干，加人磷酸盐缓冲液（4.8）3mL，涡旋溶解，备用.
7.2净化
固相萃取小柱分别用5mL甲醇（4.1）、5mL水、5mL磷酸盐缓冲液（4.8）活化.取上述提取液10mL二氯甲烷（4.4）洗脱，收集洗脱液，40C氮吹至干，准确移取1mL甲醇水溶液（4.6）溶解残渣，过0.22um滤膜后待测.
8液相色谱测定
8.1液相色谱条件
色谱柱：C，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm，或其他效果等同的C.柱.柱温：室温，流动相：甲醇水=4555. 进样量：20gL.检测器：紫外检测器或二极管阵列检测器.流速：1.0mL/min. 检测波长：215nm.
8.2标准曲线的绘制
取混合标准中间液（4.12）适量逐步稀释，用甲醇（4.1）定容，配制成浓度分别为0.5μg/ml、1.0μg/mL、5.Oμg/mL、10.Oμg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL的混合标准工作液，浓度由低到高进样，根据峰面积和浓度计算回归方程.4种巴比妥类药物液相色谱条件下标准样品图谱参见图A.1.
8.3定量测定
试料溶液（7.2）上机测定，用单点或多点校准法进行定量.多点校准法定量，根据峰面积的响应值，2
从标准曲线中得到待测样中4种巴比妥类药物的浓度（c）单点定量，根据样品峰面积的响应值与标准
溶液峰面积的响应值比值与标准溶液浓度的乘积得到待测样中4种巴比妥类药物的浓度（c）.
8.4结果计算
试料中4种巴比妥类药物的含量X，以质量分数计，单位为毫克每千克（mg/kg），按式（1）计算：
式中：
c-试料中某种巴比妥药物色谱峰面积对应的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； V一加入提取液的总体积，单位为毫升（mL）：V-氮吹至干后溶解残渣用甲醇水溶液的体积，单位为毫升（mL）；m试料的质量，单位为克（g）；V移取滤液的体积，单位为毫升（mL）.计算结果保留三位有效数字.
8.5重复性
在同一实验室、由同一操作人员完成的两个平行测定结果，相对偏差不大于10%，以两次平行测定结果的算术平均值为测定结果.
9液相色谱-串联质谱法（仲裁法）
9.1液相色谱条件
色谱柱：C柱长100mm，内径2.1mm，粒径1.7gm，或其他效果等同的C柱；柱温：40C；进样量：5pL；流动相：乙晴水，梯度洗脱，见表1：
表1液相色谱-串联质谱流动相梯度洗脱表
时间/min 水/% 乙晴/%0 0 70 300 5 70 301.0 50 504.0 20 804 01 70 3010.0 70 30
流速：0.4mL/min
9.2质谱条件
离子源：电喷雾离子源：扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）：毛细管电压：4.0kV；干燥气流速：10L/min; 干燥气温度：350C；雾化气压力：0.241MPa(35 psi）;定性离子、定量离子及对应的保留时间、毛细管出口端电压和碰撞能量见表2.
