中华人民共和国国家标准
GB/T25166-2010
Wakame
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准的附录A为资料性附录.本标准由中华人民共和国农业部提出. 本标准由全国水产标准化技术委员会海水养殖分技术委员会归口，本标准起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所.本标准主要起草人：王飞久、孙修涛、胡自民、汪文俊、王翔字、李修良.
裙带菜
1范围
本标准规定了裙带茶[Undaria pinnarijida（Harvey） Suringar]主要形态构造特征、生活周期与繁殖、遗传学特征以及检测方法.
本标准适用于裙带菜的种质检测和鉴定.
2规范性引用文件
的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
NY/T5283一2004无公害食品裙带菜养殖技术规范
3名称与分类
3.1种名
裙带菜[Undaria pinnarifida（Harv.)Suringar].
3.2分类
属（Undaria).
4主要形态构造特征
4.1外部形态特征
4.1.1孢子体形态
藻体明显分为固着器、柄和叶片三部分.裙带菜孢子体外部形态见图1.
1--固着器： 2-纳；3-叶片；
图1裙带菜孢子体的外部形态
GB/T 25166-2010
4.1.2固着器
由多次双分枝的圆柱形假根组成，其末端有吸盘.
4.1.3柄
扁平，其腹背隆起而稍圆，柄的边缘有狭窄的龙骨.藻体接近成熟时，在柄的两侧形成耳状孢子叶，孢子叶定义见NY/T5283-2004中的3.3.
4.1.4叶片
褐色具光泽.幼时长盾形，边缘光滑无缺刻，为单叶.成藻为羽状裂片，叶片的中部是由柄部延伸而来的中肋，中肋扁平隆起直达叶片的顶端.成藻一般长1.0m~2.5m，宽50cm~100cm，
4.2孢子体内部构造特征
4.2.1表皮
由一层个体小、排列紧密和整齐的细胞组成，呈栅栏状，细胞含粒状色素体.
外皮层细胞呈柱状，大小不等，排列不整齐.内皮层细胞大小相近，排列较整齐.
细胞呈丝状或树枝状，排列疏松.
5生活周期与繁殖
5.1生活史
明显的孢子体（2n，大型）与配子体（n，微型）不等世代交答型.
裙带菜的生命周期为一年.
5.3繁殖
8个月~12个月.
5.3.2无性繁殖
孢子体柄部产生孢子叶，孢子叶上产生孢子囊群，孢子囊内形成游孢子.游孢子单细胞，梨形，长9μm~11 μm，宽5μm~6yμm，有两条侧生不等长鞭毛，长的14.0μm~16.5μm，伸向前端，短的 5.3μm~7.0μm.伸向后端.
5.3.3有性繁殖
卵配方式.雄配子体产生精子囊，每个精子囊产生一个梨形精子，精子（n）长4μm~5μm.雌配子体产生卵囊，每个卵囊产生一个卵（n），卵成熟后排出体外粘着在卵囊口处与精子结合生成合子(2n).
6遗传学特征
6.1染色体数
孢子体细胞染色体数2n=60.
6.2DNA序列特征
1 ccgatcagga aggggacacc ctcctgacac taccgtcgtg cgcgtcggtt ttgtaaaccc cgagaaagaa141 cttttcaaece ccattaaact ctgastctga actcaaaagg ggggcatgcg cgcgccgcg cgcgcggcte 71211cccaacctt taacgttgta aaactttcag cg
6.2.2ITS-2序列：总长度273 bp.
1 cccctcetc ccctctett tgtgggggg gggggggttt cgggcggac tatgagtgtt ccggagcgtc71cgcgctccga gtgcacccas tetcgtgasc gaagectetc gcgccctgcc gcacagagtt gltgacggcg141 ctegcttcgg cggcgactct cgaetcacca aacgtgcgcg gggattcgc igcticattc cggcteatgc 211 ctttccccccgccce cacgcaagtg agggaggag ggaaggagag gccatatceca cac
6.2.3裙带菜不同品系核糖体1TS全序列（ITS-1ITS-2)变化幅度为0~10个碱基.
7检测方法
7.1形态构造特征检验
采用肉眼和显微镜观察相结合的方法.
7.2.1标本的制备压片法.
7.2.2染色液
2%地衣红溶于70%的乙酸中.
7.2.3染色方法
固定材料在自来水中浸泡15min~30min后压片.揭开盖片，滴人乙酸地衣红后盖片0.5h，用滤纸吸出多余的染色液，石蜡封片.
7.3裙带菜ITS序列的检测
7.3.1裙带菜配子体基因组DNA的提取
取约1g（湿重）的裙带菜配子体，加少量石英沙和PVP-40，在液氮中研成粉末.将粉末转至50mL的离心管中，加入15mL裂解缓冲液（10mmol/LTris-HCl.10 mmol/L EDTA，1.0mol/LNaCl，1.0%CTAB，1%SDS，pH=8.0)，在65C保温1h，期间摇匀儿次.用等体积的酚：三氯甲烷异戊37C保温1h，再用三氯甲烷：异戊醇（24：1.体积比）抽提一次，用2/3体积的异丙醇沉淀回收DNA.DNA 最后溶F 100 μL 的 TE(10 mmol/L Tris-HCI pH=8 0;1 mmol/L EDTA pH=8. 0)中.
7.3.2ITS特异性扩增
总反应体积为20μL含 10 mmol/LTris-HCl.pH=8.3.50 mmol/LKCl，1.5 mmol/L MgCl，Tag polymerase 1U 4种 dNTP各2 mmol/L 两个引物各 4 mmol/L~6mmol/L（正向引物 P1:5′-CGCGAGTCATCAGCTCGCATT-3’：反向引物 P2：5′-AGCTTCACTCGCCGTACTGG-3′) 模板DNA10ng.其余用双蒸馏水补满.
5 min. PCR反应参数：96C预变性5min；96C，30s；72℃，60s；55C，30s，37个循环；72C，保温
7.3.3测序
参照DNA测序仪进行测序（参见附录A）.
8判定规则
被检样品完整并符合本标准第4章要求的为合格样品.如被检样品不完整需增加第5章、第6章内容进行检验，均符合上述质量要求的为合格样品.
