中华人民共和国国家标准
GB/T25170-2010
Technical regulation of farm animals genome BAC libraryconstruction and preservation
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准由中华人民共和国农业部提出.本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274）归口 本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所.本标准主要起草人：关伟军、马月解、刘长青、潘春留、刘洪坤、甫亚斌、余露露.
畜禽基因组BAC文库构建与 保存技术规程
1范围
本标准规定了畜禽基因组BAC文库构建方法.本标准适用于猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅等畜禽的基因组BAC文库构建与保存.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，故励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准.
3. 1
基因组文库genome library
用重组DNA技术将某种生物细胞的核DNA的全部片段随机地连接到载体上再转移至适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而形成的各个片段的无性繁殖系的总集.
3.2
细菌人工染色体bacterial artificial chromosome，BAC
DNA的特性载体. 以大肠杆菌致育因子为基础，利用现代重组DNA技术体外人工合成的具有容纳高分子量外源
DNA 连接DNA ligation
在DNA连接酶催化下靶DNA片段与载体DNA相邻的5端磷酸与3'端羟基之间形成磷酸二酯键的过程.
3. 4
感受态细胞petent cells
在特定条件下细胞膜通透性发生改变，允许外源DNA进入细胞内的特殊状态下的受体细胞.
电转化electrotransformation
在高压脉冲的作用下，将外源DNA导人感受态细胞的过程.
脉冲场凝胶电泳pulse fieldgelelectrophoresis.PFGE
利用脉冲场电泳系统电场方向周期性交替变化的功能而分离和鉴定生物大分子的技术.
3.7
重组体rebinant
两种以上不同来源的DNA片段连接所形成的杂种DNA分子.
GB/T 25170-2010
4试剂及溶液配制
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂.实验用水要符合GB/T6682中一级水的要求.
4.1LB培养冻存缓冲液（luria-bertani media）
360 mmol/L K:HPO 13. 2 mmol/L KH;PO 1. 7 mmol/L 柠檬酸钠•0. 4 mmol/ L MgSO 6.8mmol/L（NH);SO ，4.4%甘油，定容至100mL，应用时以冻存缓冲液与LB液体培养基1：9的比例配制.
用二甲基甲酰胺溶解X-gal.配成20mg/mL贮存液，一20℃C避光保存.
4. 31 mol/L Tris-CI
121.10g/L Tris 碱溶于 800 mL/L双蒸水（double distilledHO，ddH;O）中，用HCI调pH 至8.0，定容至1000mL，高压灭菌.
4.4内切酶缓冲液
10 mg/mL BSA，10×酶反应缓冲液，1 mmol/L DTT，1 mmol/L亚精胺.
4.5SOC培养基
称取 20.00 g 胰化蛋白陈，5.00 g酵母提取物，0.50g NaCl，量取 2.5 mL 1 mol/L KCl 10 mL2mol/1MgSO或MgCl溶于980mLddH;O，高压灭菌后冷却至60C以下，加人10mL2mol/L 葡萄糖溶液.
4.6异丙基硫代-β-D-半乳糖苷溶液（isopro pylthio-β-D-galactoside，IPTG）
称取1.00gIPTG溶于5.0mL双蒸水中，过滤除菌装成1mL/份，贮存于-20℃C，
4.7琼脂糖块储存液
磁力搅拌器上搅择，调pH至8.0后，加ddH O定容至1000mL，高压灭菌. 800 mL ddHO中加人 186. 10 g 乙二胺四乙酸二钠(ethylene diamine tetraacetic acid EDTA)，在
4.8CsCI密度梯度离心纯化液
3.3mL饱和CsC1-加灭菌石蜡油至总体积10mL.
4.9二烷基肌氨酸钠缓冲液（N-Dodecanoyl-N-methylglycine sodium salt，NDS）
至9.5，用ddHO定容至1L，过滤灭菌. 称取 186.00g EDTA和 1.20g Tris-CI溶于 700 mL ddHO 中 调 pH 至 8.0加入 NDS调 pH
4.10抗凝剂（柠橡酸钠葡萄糖液）
称取0.48g柠橡酸、1.32g柠檬酸钠、1.47g葡萄糖，用ddHO定容至100mL，高压灭菌.
4.11氯霉素
乙醇配制，工作浓度为12.5μg/mL，20℃保存.
4. 12 Tris(10 mmol/L pH8. 0)EDTA(1. 0 mmol/L pH8. 0)缓冲液、TE10 mmol/1 pH8 0 Tris-Cl 1. 0 mmol/L pH8 0 EDTA，高压灭菌，室温保存.
4.13LB液体培养基
ddHO中，调pH至7.4，定容至1L，高压灭菌. 称取10.00g细菌培养用胰蛋白陈、5.00g细菌培养用酵母提取物、10.00gNaCl溶于800mL
4.14LB固体培养基
称取10.00g细菌培养用胰蛋白陈、5.00g细菌培养用酵母提取物、10.00gNaC1，溶于800mLddHO中，调pH至7.4，加人15.00g细胞培养用琼脂，定容至1L，高压灭菌.
4.15含特定抗生素培养基
按照4.14的方法配制好LB固体培养基高压灭菌后待其不烫手时按2mL培养基：1pl氯霉素（12.5μg/mL）的比例添加氯霉素，倒20mL培养基于90mm培养板中.待培养基凝固后，将40pL
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X-gal和7uLIPTG混匀后，均匀涂于培养基表面，超净台里晾干备用.
4.16碱裂解液I
4℃保存. 50 mmol/1 葡萄糖，25 mmol/L pH8. 0 Tris-Cl 10 mmol/1 pH8.0 EDTA 定容至 1 L 高压灭菌，
4.17碱裂解液Ⅱ
0.2mol/LNaOH，1%SDS，现用现配.
4.18碱裂解液Ⅲ
1.32mol/L乙酸甲，4C保存.
5主要仪器、设备
水浴锅、电热恒温鼓风干燥箱、培养箱、电子天平、一80C低温冰箱、超纯水仪、低温离心机、凝胶自动成像分析系统和脉冲电泳仪等.
6基因组BAC文库构建
6.1高分子量DNA制备
6.1.1细胞收集
6.1.1.1家禽血细胞的收集
采集3.0mL~5.0mL畜禽新鲜血液，立即注人含1mL肝素钠（500U/mL）或柠橡酸钠葡萄糖的离心管中抗凝.4℃C下，4500g离心5min，弃上清，加人等体积预冷的pH7.0磷酸盐缓冲液《phosphate buffered saline，PBS），混匀.上述血细胞收集步骤重复离心3次后，加人1.O mL PBS重悬细胞，重悬细胞后计数，将血细胞密度稀释到1.0×10*个/mL~2.5×10个/mL.
6.1.1.2家畜血细胞的收集
采集10mL~20mL家畜新鲜血液，加人等体积红细胞裂解液，37C下放置1h，4℃下，583g离心5min，其余步骤同6.1.1.1.
6.1.1.3畜禽其他组织细胞收集
过滤.其余步骤同6.1.1.1. 在干冰或液氮存在的条件下，将新鲜的畜禽组织碾成粉末，悬浮在PBS中，振荡混匀，用两层纱布
6.1.2细胞裂解
取细胞密度为1.0×10个/mL~2.5×10*个/mL的悬液和1%低熔点琼脂糖在45℃下放置5min后，等体积混匀，隔3min~5min再混匀一次.将100pL混合液置于专用模具中，4C下放置15min~3 h后更换相同缓冲液，再50C水浴24 h~28h.用30 mLTE缓冲液（pH7.6)在30 min 内洗涤3 次（冰 30min形成凝胶块.将凝胶块置于含有0.1mg/mL蛋白酶K和30mL1%NDS缓冲液中，50℃下水浴上操作）以去除TE缓冲液，置于 1.0 mmol/L苯甲基磺酞氟（phenyl methyl sulfonyl fluoride，PMSF）中，50℃下水浴30min，中间换液一次，将凝胶块储存于0.5mol/LEDTA（pH8.0）中4C可保存半年.
6.1.3基因组DNA酶切与回收
制性内切酶缓冲液中，冰浴1h，中间换液1次.分别移至不同酶量（1U~20U）的酶切缓冲液中，冰上 将凝胶块在4℃下用30mLTE缓冲液浸泡3h~4h，中间换液3次~4次.置于1mL的适宜限渗透1h后，37C下酶切10min~30min，用1/10体积0.5mol/LEDTA（pH8.0）终止反应.将不完全消化的DNA凝胶块在0.5×TBE中，13C，180V~120V.120角，脉冲时间60s~10s条件下进行PFGE电泳.电泳时间 16 h~24 h.
6.1.4最适DNA片段获得
6.1.4.1第一次电泳选择
用1%琼脂糖凝胶电泳分离酶切获得的大分子量DNA，电泳条件同6.1.3.电泳时间24h.电泳结
