中华人民共和国国家标准
GB/T 25878-2010
对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒 (IHHNV)检测PCR法
Polymerase chain reaction （PCR） method for infectious hypodermal andhaematopoietic necrosis virus (IHHNV)
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A和附录B为资料性附录.本标准由全国水产标准化技术委员会归口. 本标准由中华人民共和国农业部提出.本标准起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、农业部全国水产技术推广总站.本标准主要起草人：黄健、杨冰、朱泽闻、宋晓玲、孙喜模、赵红萍、刘莉.
对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒 （IHHNV）检测PCR法
使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件. 警告：使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出可能的安全问题.
1范围
本标准规定了对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）聚合酶链式反应（PCR）检测方法的原理、所需试剂和材料、仪器和设备、操作步骤和结果判定.
本标准适用于对虾、环境生物、饵料生物和其他各种非生物样品中传染性皮下及造血组织坏死病毒（1HHNV)的定性检测.不适于对病毒量或感染活性的估测以及宿主感染程度的评估.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
SC/T7202.1-2007斑节对虾杆状病毒诊断规程第1部分：压片显微镜检查法
SC/T7202.2-2007斑节对虾杆状病毒诊断规程第2部分：PCR检测法
3原理
3.1对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒及其流行特征
传染性皮下及造血组织坏死病毒（infectious hypodermaland hsematopoietic necrosis virus IHHNV）粒子大小为20nm~22nm，是无囊膜二十面体，在氯化锥中的浮力密度为1.40g/mL，含线 状单链DNA，长度为4.1kb，农壳由4个分子质量分别为74kD、47kD、39kD、37.5kD的多肽组成，
1HHNV可感染世界各地的养殖对虾，其感染细角滨对虾（Litopenaea stylirostrix）会引起急性传染病和高死亡率（90%），稚虾受到的危害最严重.1HHNV感染凡纳滨对虾（Litopenaesmnamei）通过垂直和水平传播.
3.2技术原理
IHHNV 的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是以 1HHNV 的一段389 个碱基（b)长度的特异性DNA序列作为模板，以与模板两端序列互补的一对特异性寡核苷酸序列作为引物，在四种脱氧核糖核苷三磷酸存在下，利用依额DNA的DNA聚合酶的合成作用，经过数十次变性、退火和延伸的反应循环，使模板上介于两个引物之间的DNA片段得到特异性地级数扩增，再通过电泳等手段检 测到被特异性扩增的片段，从面揭示微量1HHNVDNA的存在.
4试剂和材料
4.1所需试剂除引物、阳性对照和阴性对照以外，按照SC/T7202.2-2007中第5章的规定. 4.2100 ng/μL 引I物F：5′-CGG-AAC-ACA-ACC-CGA-CTT-TA-3'，-20 C保存.4. 3 100 ng/μL 引I物 R:5′-GGC-CAA-GAC-CAA-AAT-ACG-AA-3′ -20 C 保存.4.4阳性对照为已知1HHNV阳性的组织样品的DNA模板，20C保存.
GB/T 25878-2010
4.5阴性对照为已知1HHNV阴性的组织样品的DNA模板，-20C保存.4.6空白对照以无菌双蒸水为模板.
5仪器和设备
所需仪器设备按照SC/T7202.2-2007中第6章的规定.
6操作步骤
6.1反应体系的准备
6.1.2PCR反应可选择25yL50gL或100gL反应体系进行.6.1.3在PCR前区按表1的要求，加人除Taq酶以外的各项试剂，配制成无酶反应预混物，保存于一20℃C.在临用前，根据所需的反应份数，取出无酶反应预混物，加入相应体积的Taq酶，混匀，即成完 全的反应预混物.按1份/支分装到0.2mLPCR管中.如果PCR仅不具备热盖功能，再向各管内加人50pL液体石蜡.暂存于4℃.
6.1.1PCR反应体系的准备应在洁净区完成.
表1100份PCR反应预混物所需试剂组成
试剂 25 pl.体系 50μL.体系 100 gL.体系 试别终浓度10×PCR缓冲液（无Mg²） 250 μl 500 yl. 1 000 yxL. 1×氧化镇(25 mmol/L) 200 μL 400 yxl 800 μpl. 2. 0 mmol/LdNTP(10 mmol/L) 100 μL 75 μl. 200 yL. 400 μpI. 400 μmol/1.100 ng/p1. 引|物 R 100 ng/pl. |物 F 75 μL. 150 xl 300 pI. 3 ng/pl.灭菌双蒸水 1 725 pl. 3 450 μL 150 yL 6 900 xL 300 pI. 3 ng/pl.Taq DNA 聚合酶(5 U/μL) 25 μL 50 yL. 100 pl 0. 05 U/μL100份反应总体积 2 450 pl 4 900 xL 9 800 cL 注1：25pL体系模板量0.5xl/反应管.注2：50pl体系模板量1xL/反应管.注3：100gL体系模板量2μL/反应管.
6.2样品准备
6.2.1样品的处理应在样品区完成.
6.2.2样品采集的要求按SC/T7202.1-2007中附录B的规定执行.
6.2.3活体或冰冻幼体、仔虾及体长在3cm以下稚虾个体样品约5mg~100mg（去掉稚虾眼）.活体或冰冻的虾鲲、胃、游泳足或步足样品约5mg~100mg.活体或冰冻饵料生物样品约5mg~100mg.池底表土样品约500mg.将上述待检样品放人灭菌1.5mL微型离心管中，应避免各样品间的交叉污染.非一次性使用的样品处理工具要经清洗然后浸于新配制的有效氯含量为3.0×10的含氯
按照SC/T7202.22007中7.1.3的规定执行.
6.4PCR扩增
6.4.1在PCR前区，按照表1对各反应体系所需的模板体积要求，向各支含有1份反应预混物的PCR管内加人相应体积的各样品DNA提取液，并设阳性对照、阴性对照和空白对照.
6.4.2将上述加有样品模板的PCR管带人PCR后区，置于PCR仪中按以下程序进行扩增：95℃2
5min；95C30s、55℃30s、72℃1min，35个循环：72℃延伸7min，最后4C保温.准备进行产物的电泳.
6.5PCR产物电泳
按照SC/T7202.22007中7.1.5~7.1.8的规定执行.
7结果判定
7.1阳性对照和阳性样品在389bp处应有一条特定条带出现：阴性对照和阴性样品在389bp处应无有条带出现都表明PCR失败应在排除故障和清除污染后，重新取样检测.对虾传染性皮下及造血组 条带出现，空白对照不出现任何条带.阳性对照在389bp处无特定条带出现或阴性对照在389bp处织坏死病毒（IHHNV）PCR检测产物序列参见附录A.7.2条带的亮暗表示扩增产物浓度的多少，但并不对应于模板的量的多少.7.3阳性结果表明被检样品中存在IHHNVDNA.对活虾和敏感宿主面言，提示已受IHHNV感染；对冰鲜或冰冻对虾面言提示曾受到IHHNV感染.
7.4电泳结果的分析和间题排除方法参见附录B.
