中华人民共和国国家标准
GB/T26322-2010
工业循环冷却水中亚硝化菌的测定 MPN法
Examination of nitrite bacteria in industrial circulating cooling waterMPN test
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由中国石油和化学工业联合会提出. 本标准由全国化学标准化技术委员会水处理剂分会（SAC/TC63/SC5）归口.本标准负责起草单位：中海油天津化工研究设计院、广州市特种承压设备检测研究院.本标准主要起草人：张全、李琳、黎华、腺厚开、杜玉辉.
工业循环冷却水中亚硝化菌的测定 MPN法
1范围
本标准规定了工业循环冷却水中亚硝化菌的测定方法.
本标准适用于工业循环冷却水中亚硝化菌的测定也适用于原水、生活用水及黏泥中亚硝化菌的测定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
NEQ) GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备（GB/T6032002，1SO6353-1：1982，
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987 MOD）
3方法提要
在28℃~30C下，恒温培养试样14d后，先采用格里斯氏（Griess）试剂定性判断亚硝化菌的存在.如果溶液呈红色，表明为阳性反应：如果溶液未呈红色，表明为阴性反应.再采用MPN技术对被测试样中的亚硝化菌进行计数.
4试剂和材料
4.1本标准所用试剂，除非另有规定，应使用分析纯试剂和符合GB/T6682中三级水的规定.
试验中所需制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T603之规定制备.4.3碳酸钙 4.2硫酸铵.4.4磷酸二氢钠4.5磷酸氢二钾.4.6硫酸锰（MnSO4H;O）.4.7硫酸镁（MgSO7H:O）. 4.8对氨基苯磺酸，4.9x萘胺.4.11乙酸溶液（10%). 4.12氢氧化钠溶液：40g/L.4.13乙醇溶液：体积分数为75%.4.14牛皮纸.
4.10盐酸溶液：111.
GB/T 26322-2010
4.15医用脱脂纱布.4.16医用脱脂棉.
5仪器、设备
5.1无菌箱（室）或超净工作台.5.2燕汽压力灭菌器.5.4电热干燥箱：温度可控制在60℃C~280℃ 5.3生化培养箱.5.5刻度吸管：1ml.5.6刻度吸管：10ml.5.7试管：d20mm×200mm.5.8试管架. 5.9磨口试剂瓶：1000mL.5.10容量瓶：1000 ml.5.11携瓷量杯：1000mL.5.12白色比色瓷板，
6试验前准备
6.1无菌稀释水的制备
6.1.1生理盐水的配制：称取8.5g氯化钠，溶解在1000mL水中，混匀.6.1.2将生理盐水分装在d20mm×200mm的试管中，每管9mL，塞上棉塞，用牛皮纸把试管口包
好，用蒸汽压力灭菌器于（121±1）℃灭菌15min~30min.
6.2富集培养基的制备
称取下列试剂：
硫酸铵 (NH );SO 2 0 g;磷酸二氢钠 磷酸氢二钾 NaH PO K;HPO 0 25 g: 0 75 g;碳酸钙 CaCO; 5.0 gt硫酸锰 MnSO 4H;O 0 01 g硫酸镁 MgSO 7H; O 0.03 g-
用热水补充至100mL，用氢氧化钠溶液调节pH值至7.0~7.2.并分装在d20mm×200mm的试管 将上述试剂加水约950mL，在电炉上加热溶解后，趁热用四层医用脱脂纱布过滤于携瓷量杯中.中，每管10mL，塞上棉塞，用牛皮纸把管口包好.十个一捆，用蒸汽压力灭菌器于（121土1）℃灭菌15 min~30 min.
6.3指示剂的制备
格里斯氏（Griess）试剂
A液：对氨基苯磺酸0.5g，乙酸溶液（10%）150mL，保存在棕色瓶中B液：α萘胺0.1g，水20mL，乙酸溶液（10%)150mL，保存在棕色瓶中.
6.4刻度吸管的灭菌
6.4.1将洗净并烘干后的吸管粗端塞上医用脱脂棉，棉花量要适宜，长度大约10mm~15mm，棉花6.4.2每支刻度吸管用一条约40mm~50mm宽的牛皮纸条，以45左右螺旋形卷起来，吸管的尖部 不宜露在口外，多余的棉花可以用火焰烧掉.在头部，粗端将多余的纸条折叠打结，不使散开，标上量度，若干支扎成一束，置电热干燥箱中，于（160土2）C灭菌2h，
6.5采样瓶的灭菌
(160±2)C灭菌2h. 将洗净并烘干后的1000mL磨口试剂瓶瓶口和瓶颈用牛皮纸包好，扎紧，置电热干燥箱中，于
7测定步骤
7.1将待测试样放入无菌箱（室）中，立即用体积分数为75%的乙醇溶液浸泡的医用脱脂棉球擦手，点7.2用10倍稀释法稀释试样.即用1mL无菌刻度吸管吸取1mL待测试样注入到9mL无菌稀释 燃无菌箱（室）内的酒精灯，试样的稀释和接种操作应在无菌箱（室）内的火焰区进行.水管中，充分摇匀，此时稀释度为107.3另取一支1mL无菌刻度吸管吸取1mL稀释度为10的试样移到第二个无菌稀释水管中，充分摇匀，此时稀释度为10一，以此类推，直至需要的稀释度为止.7.4将水样（包括稀释水样）分别接种于装有培养基的试管中，试管置试管架上，每个稀释度重复接种5管（也可根据需要重复接种3管或4管），每管接种1mL，每接种一个稀释度更换一支无菌吸管.7.6培养：在生化培养箱中于28C~30C恒温培养14d 7.5另取一组试管培养基不接水样，作为空白.
8计数与报告
两滴（格里斯氏试剂A液和B液应按顺序加人）.如果溶液呈红色，则表示有亚硝化菌存在，以"”（阳
8.1取出少量培养液（约5滴）于白色比色瓷板小窝中，依次加入格里斯氏（Griess）试剂A液和B液各8.2如果空白出现阳性反应，说明测定过程中有污染，本次测定无效. 性）表示：如果溶液未呈红色，则表示无亚硝化菌存在，以“一”（阴性）表示.8.3计算出10进位稀释管中阳性试管数，以阳性组合指数记录下来.8.4在10进位稀释中多于3个稀释度时，阳性组合的指数只需要用其中依次的3个稀释度，对这3个稀释度的选择原则是先选出5管全部阳性反应的最大稀释度，然后选出其次相连的2个更高的稀释度，计算出阳性组合指数（见表1中示例1、示例2、示例4）.8.5若按照8.4规定的原则选出3个稀释度后，有更高的稀释仍然产生1个阳性试管，就应将这一阳8.6根据阳性组合的指数，查附录A中表A.1得出最大可能菌数（MPN）除以阳性组合指数的第一位 性试管并人所选择的最高稀释的阳性结果中（见表1中示例3）.数字的稀释度数，即为每毫升水样中亚确化菌的菌数（如果每个稀释度重复接种4管或者3管，根据阳
性组合的指数查附录B中表B.1或附录C中表C.1）.
