中华人民共和国国家标准
GB/T26351-2010
抗药性检测方法 德国小不敏感乙酰胆碱酯酶法
Testmethodsofcockroachresistance toinsecticides-Test methods of insensitive acetylcholinesterase for Blattella germanica
中华人民共和国卫生部 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口.
本标准起草单位：北京市疾病预防控制中心、中国农业大学、中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所.
本标准主要起草人：曾晓芃、高希武、马彦、钱坤、佟颖、梁沛、赵彤言.
抗药性检测方法 德国小不敏感乙酰胆碱酯酶法
1范围
本标准适用于德国小嫌对有机磷、氨基甲酸酯类药剂抗药性的生物化学检测.
2术语和定义
下列术语和定文适用于本文件.
2.1
乙酰胆碱酯酶区分浓度disecriminating concentration of acetylcholinesterase
能够抑制敏感品系德国小巍乙酰胆碱酯酶正常活性90%的杀虫药剂的浓度，单位为mol/L或mmol/L
2.2
F1代F1 generation
从现场捕捉的德国小蝶，繁殖后得到的第一代.
3试虫
现场采集德国小蝶，室内饲养，F1代羽化后7d~15d的雄性德国小蝶.冰浴条件下储存不超过1d，一20C条件下储存不超过1周或一80℃条件下储存6个月以内.
4试剂
4.1磷酸氢二钠（NaHP()），化学纯.4.3曲拉通X-100（Triton X-100). 4.2磷酸二氢钾（KHPO），化学纯，4.4乙酰硫代胆碱（ATCh），分析纯.4.55，5'-二硫双硝基苯甲酸（DTNB），分析纯.4.6磷酸缓冲液（0.1 mol/LpH7.5PBS）：称取30.18gNaHPO12HO和2.16 gKH-PO蒸馏水定容至1000ml.后用蒸馏水定容至250mL.4C避光保存.4.8ATCh溶液：称取28.9mgATCh溶于10mL蒸馏水中，-20C避光保存.4.9ATCh-DTNB混合溶液：称取75mgATCh和13mg DTNB.用100mL磷酸盐缓冲液溶解.
GB/T 26351-2010
5分光光度法
5.1仪器设备
5.1.1分光光度计. 5.1.2恒温水浴箱.5.1.3玻璃组织匀浆器.5.1.4台式冷冻离心机（离心力10000g以上）.5.1.5加液器.
5.2杀虫药剂的配制
虫药剂对敏感德国小蝶品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度参见附录A）的2倍，溶剂在反应体系中的最终浓 用丙酮或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液，实验前用磷酸盐缓冲液稀释到区分浓度（常见杀度应小于1%.
5.3操作步骤
5.3.1将单头德国小雄性成虫放人4℃预冷的玻璃组织匀浆器中，加人1mL4℃预冷的磷酸盐缓5.3.2匀浆液在4C，10.000g.离心15min，弃沉淀，取上清即为酶液冰溶保存备用. 冲液（pH7.5，0.1mol/L，含0.1%TritonX-100），充分匀浆.5.3.3取4支试管，分别加人上述酶液0.1mL，在其中3支试管中分别加人杀虫药剂水溶液0.1mL，使其终浓度达到区分浓度，第4支试管中加人0.1mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对照管：另取1支试管加人0.2mL磷酸盐缓冲液，作为空白对照.温15min后，加人1.6m1DTNB-乙醇显色剂.5.3.5以空白对照调分光光度计0点，于412nm波长下测定无药剂对照管和药剂处理管的光密度值(OD).5.3.6按上述方法检测100头德国小.
5.4结果表述
测定AChE残存活性的计算见公式（1）.
式中：
E-AChE残存活性；OD-药剂处理管平均光密度值OD；OD---无药剂对照管平均光密度值OD
5.5判别标准
AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE.具有不敏感AChE的个体为对有机磷或氨基甲酸酯类药剂具有抗性的个体，抗性个体在种群中的比例达到10%时为抗性种群.
6酶标仪法
6.1仪器设备
6.1.1酶标仪. 6.1.2恒湿水浴箱.6.1.3玻璃组织匀浆器.6.1.4台式冷冻离心机（离心力10000g以上）.6.1.5加液器.
6.2杀虫药剂的配制
用丙酮或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液，实验前用磷酸盐缓冲液稀释到区分浓度（常见杀虫药剂对敏感德国小蝶乙酰胆碱酯酶的区分浓度参见附录A）的2.5倍，溶剂在反应体系中的最终浓度应小于1%.
6.3操作步骤
6.3.1将单头德国小雄成虫，放人4℃预冷的玻璃组织匀浆器中，加人1mL4℃预冷的磷酸盐缓冲液（pH7.5，0.1mol/L，含0.1%TritonX-100)，充分匀浆.
6.3.2匀浆液在4℃，10000g离心15min，弃沉淀，取上清即为酶液，冰溶保存备用.
6.3.3在酶标板中的4个孔中分别加入上述酶液0.1mL.在其中3个孔中分别加人一定浓度的杀虫药剂溶液0.05ml，使其终浓度达到区分浓度，第4个孔中加入0.05mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对 照管，在30℃保温5min后，分别加人0.1mLATCh-DTNB混合溶液，在412nm测定5min时间动力学曲线，曲线的斜率作为反应初速度（v).计算平均值.
6.4结果表述
测定AChE残存活性的计算见公式（2）
..( 2 )
式中：
E AChE残存活性；药剂处理组平均反应初速度；--无药剂对照组平均反应初速度.
6.5判别标准
AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE，具有不敏感AChE的个体为对有机磷或氨基甲酸酯类药剂具有抗性的个体，抗性个体在种群中的比例达到10%时为抗性种群.
