中华人民共和国国家标准
GB/T27765-2011
SiO2、TiO2、FeO4及Al2O纳米颗粒 生物效应的透射电子显微镜检测方法
Testing methods of SiOTiOFeOand AlOnanoparticles biological effect bytransmission electron microscope(TEM)
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本标准由全国纳米技术标准化技术委员会（SAC/TC279）提出并归口本标准负责起草单位：中国人民解放军第二军医大学、复旦大学及地科院矿产资源研究所.本标准主要起草人：杨勇骥、俞彰、周健雄、张天宝.
SiO、TiO、FeO及AlO纳米颗粒 生物效应的透射电子显微镜检测方法
1范围
本标准规定了透射电子显微镜检测含有SiO、TiO、FeO，及AlO纳米颗粒材料的生物试样的技术和规范.
本标准适用于SiO、TiO、FeO.及ALO纳米颗粒材料的生物效应透射电镜检测的生物薄试样超微结构分析.
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GB/T19619-2004纳米材料术语
ISO/IEC 17025：2005检测和校准实验室认可准则（Generalrequirements for the petence oftesting and calibration laboratories)
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1
纳米颗粒nanoparticles
纳米尺度的固体粒子.本标准中出现的纳米颗粒材料特指为SiO、TiO、FeO及AlO纳米颗粒材料.
3.2
生物效应biologicaleffect
纳米材料与生命过程的相互作用产生的生理功能、生化功能及形态结构的变化.
生物效应检测biological test
3. 4
生物薄试样thin biological sample
生物薄试样是指采用超薄切片机切成的、厚度为40nm~100nm的生物试样，用于透射电镜观察.
4基本原理
纳米颗粒材料的表面理化特性使其易形成团聚，经分散后与生物体接触.纳米颗粒材料与生物体接触后，需采用超微结构制样方法，将其制成生物薄试样，在透射电镜下检测纳米颗粒材料作用于生物
GB/T 27765-2011
体后产生的细胞及细胞器的超微结构变化，以确定纳米颗粒材料对生物体的生物效应作用.用聚焦的高能电子束照射生物薄试样的微小区域，人射的电子束大部分透过薄试样，形成透射电子，透射电子中上成像，形成生物薄试样的超微结构图像. 含有大量携带有生物薄试样内部信息的非弹性散射电子，非弹性散射电子在荧光屏、照相底片或CCD
5仪器设备和材料
5.1仪器设备
5.1.2超薄切片机， 5.1.1透射电子显微镜.5.1.3制刀机，5.1.4玻璃刀或钻石刀.5.1.5恒温烘箱（30℃~70℃）.5.1.6超声波清洗仪.
5.2材料
5.2.1戊二醛.5.2.2四氧化银. 5.2.3乙醇5.2.4丙酮.5.2.5环氧树脂-5.2.6醋酸双氧轴.5.2.7枸橡酸铅.
6仪器的环境条件
超薄切片机、透射电子显微镜的工作环境应符合以下要求：
6.1超薄切片机
6.1.1切片室应为超薄切片专用房间，6.1.2相对湿度小于60%.6.1.4电源电压：220（1±10%）V 6.1.3温度：（20±5）℃，
6.2透射电子显微镜
6.2.1电镜室应为电镜专用房间，6.2.2相对湿度小于60%. 6.2.3温度：(20±5）℃.6.2.4杂散电磁场干扰应小于0.1gT.6.2.5电源电压及频率应稳定[220（1±10%）V.50Hz±1Hz].6.2.6具备仅器专用地线，接地电阻应小于100Ω.
7纳米颗粒材料分散
7.1将纳米颗粒材料与溶剂按一定的比例充分混和.7.2放入超声波清洗仅中分散.注：建议分散的条件：水温（25~30）℃；功率300W;频率40（1±10%）kHz;时间30min左右.
8.1纳米颗粒材料
8.1.1将不同浓度、已分散的纳米颗粒悬液滴在有支持膜（一般用火棉胶或Fomvar膜）的3mm透射电镜专用载网上.8.1.2将滴有纳米颗粒材料悬液的电镜专用载网放入恒温烘箱中，60℃烘烤2h.
8.2生物组织
8.2.1取材：将生物组织在（2~3）%戊二醛固定液（4C）中迅速切成小于1mm²的小块.配制戊二醛固定液可参考附录C.8.2.2前固定：将小块组织浸泡在20倍体积、4℃C的（2~3）%戊二醛固定液中固定（1~4）h，用缓冲液 充分漂洗.8.2.3后固定：将生物小块组织浸泡在1%银酸，4C固定2h.配制俄酸可参考附录D.8.2.4脱水：用乙醇或丙酮梯度脱水.建议乙醇或丙酮梯度脱水的顺序为：30%、50%、70%、90%乙醇各一次：90%丙酮1次，100%丙酮3次：每次（10~15）min.8.2.5包埋：在按比例配制好的环氧树脂（以Epon812为例，配制比例可参考附录B）中浸透后，在胶囊 （或硅胶包埋板）内进行包理.建议浸透比例为，丙酮：包理剂（浸透时间）：1：1[（1~2）h]：12（12h）；纯包理剂（1 h）.8.2.6聚合：在恒温烘箱内进行聚合，37C聚合12h后，升温至60C聚合（36~48）h.8.2.8超薄切片：采用超薄切片机将已修好的包埋块切成超薄切片，厚度一般要求在（40~100）nm. 8.2.7修块：包埋块在进行超薄切片之前，将分析部位修成易于超薄切片的形状.8.2.9染色：采用醋酸轴和枸橡酸铅对超薄切片进行双重金属染色后待检.
8.3培养细胞
8.3.1前固定：用橡皮刮将细胞从培养Ⅲ底部刮下或胰酶消化下来，低速离心（800g.5min）成小团 块，弃上清，沿管壁加人（2～3）%戊二醛固定液，放人4℃冰箱固定（1～4）h.用缓冲液充分漂洗.8.3.2后固定：经戊二醛固定的细胞团块用缓冲液轻轻漂洗后，加人1%俄酸，放人4C冰箱固定1h，8.3.3脱水（同8.2.4）.8.3.4包埋（同8.2.5）8.3.5聚合（同8.2.6）. 8.3.6修块（同8.2.7）.8.3.7超薄切片（同8.2.8）.8.3.8染色（同8.2.9）.
