中华人民共和国国家标准
GB/T28066-2011
Detection and identification of Pseudomonas syringaepv. pisi (Sackett)Young et al.
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.
本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：林石明、黄蓬英、易建平、陈青、廖富荣、吴媛、陈红运、王宏毅.
丁香假单胞杆菌豌豆致病型 检疫鉴定方法
1范围
本标准适用于植物种子、苗木等植物及其产品中丁香假单胞杆菌豌互致病型的检测和鉴定. 本标准规定了丁香假单胞杆菌豌豆致病型生物学、血清学及分子生物学的检测鉴定方法.
2丁香假单胞杆菌豌豆致病型基本信息
中文名：丁香假单胞杆菌豌豆致病型.
中文别名：豌豆（细菌性）枯萎病菌或豌豆细菌性叶斑病菌、豌豆假单胞蔓枯病菌或茎枯病菌等.
病害英文名：bactrial blight of pea.
异名:Bacteiam pisi (Sackett) Smith1920:Chlorobacter pisi (Sackett) Patel &. Kulkarni 1951:Pseudomonas pisi Sackett 1916: Pseadomonas syringae Van Hall. 1902: Pyfomonas (Sackett)Bergey et al. 1923.
属原核生物界Procaryotes，变形细菌门 Proteobacteria，Y-变形细菌纲Gammaproteobacteria，假单胞杆菌目 Pseudomonadales，假单胞杆菌科 Pseudomonadaceae，假单胞杆菌属Pseadomonas.
丁香假单胞杆菌豌豆致病型的其他信息参见附录A.
3方法原理
依据病菌在培养基上生长的菌落形态、碳源的利用情况、基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸等进行检测鉴定.
4主要试剂
本标准的检测鉴定方法主要使用以下试剂：
硫酸镁、磷酸氢二钾、蔗糖、甘油、硼酸、氯化镁、蛋白陈、生理盐水、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、Tris头孢呋辛酸、澳酚蓝、放线（菌）酮或制霉菌素和PCR相关试剂. 盐酸、EDTA、SDS（十二烷基硫酸钠）、CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）、溴化乙锭、头孢氨苄、万古霉素、
5主要仪器
本标准的检测鉴定方法主要使用以下仅器：
超净工作台、高压灭菌锅、显微镜、培养箱、电子天平、离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、BIOLOG微生物鉴定系统和酶标仪.
6病菌分离
6.1种子样品的制备
桶内，加3L无菌水，搅拌，用无菌（新）的塑料袋严密封盖，4℃下静置16h~18h或过夜；去掉塑料袋， 检查皱缩种子和其他为害状的种子.每份种子检测样品至少检测2000粒种子.将种子倒人5L充分搅拌.取种子浸出液10mL 用15000g离心5min，用蒸馏水分2次（每次1mL）洗下沉淀物，制成种子浸出液，以备分离培养.
6.2种子中病菌的分离培养
3个~10个重复，无菌水作为空白对照. 取100pL的种子浸出液涂布于P3和（或）S4培养基平板上（培养基配制见附录B）.每个样品设
在25℃土2℃下黑暗中培养.3d后开始观察.
行纯化（培养基配制见附录B），纯化3次后进行生化鉴定、DAS-ELISA或PCR等方法鉴定.
表1培养基上的菌落特征
S4培养基Pspi的菌落肩平状，白色，透明，边缘不规期 多数菌株有蓝色荧光 Pspi的菌落较大，半球形，白色，边缘整齐
6.3植物组织中病菌的分离培养
一滴无菌水，置于载玻片上，盖上盖玻片后在显微镜下观察.如果观察到细菌的菌脓，则进行分离培养. 仔细检查植物叶片、豆荚等组织的症状（参见图A.1），用无菌刀片将可疑的病斑切成细的切块，加
选择新鲜症状的叶片、豆荚等组织，切取病斑前沿部分2mm~7mm的组织，用70%酒精表面消毒15s，无菌水洗2次~3次，在S4和（或）P3培养基平板上划线分离.
在25℃士2C下黑暗中培养3d后，开始观察.
如果在培养基上产生可疑菌落（菌落特征见表1），则将菌落转移至KB平板上培养1d~2d进行纯化，纯化3次后进行生化鉴定、DAS-ELISA或PCR等方法鉴定.
7病菌签定
7.1生化鉴定
采用BIOLOG微生物鉴定仅对可疑菌落进行生化鉴定.
7.2DAS-ELISA方法
将可疑菌落配制成10CFU/mL悬浮液，取100uL悬浮液作为检测样品.每个检测样品重复一次，用已知菌株作阳性对照，用缓冲液作空自对照.
具体操作步骤见附录C.
7.3PCR方法
基中（培养基配制见附录B），25C士2℃下振荡培养过夜，离心后提取沉淀的DNA，进行PCR扩增. 将可疑菌落制备成10CFU/mL的细菌悬浮液，进行PCR扩增.或者把可疑菌落接种到NB培养用已知菌株作阳性对照，用无菌水作空白对照.
具体操作步骤见附录D.
7.4致病性测试
如果生化鉴定、DAS-ELISA或PCR方法中一种或一种以上方法的检测结果产生阳性，则进行致病性测试以确认鉴定结果.
将豌豆种子播种于小盆中，待长出2片~3片真叶的小苗.取在KB培养基上培养24h~48h的菌落，用消毒的昆虫针蘸取菌落，在最为幼嫩的秸秆处进行刺伤接种.每个菌落接种5株小苗.5d～7d后，观察是否产生致病性.如果出现扩展型的水渍状病斑，则有致病性：反之，则没有致病性.
注：有些Pspi的菌株在接种1d~2 d后，就引起小苗例伏.
8结果判定与检测报告
8.1结果判定
8.1.1未分离到可疑菌落
如果经S4或P3培养基分离培养，7d后仍未产生可疑菌落，则未检出Pspi.
8.1.2分离到可疑菌落
如果生化鉴定、DAS-ELISA或PCR检测中一种或一种以上方法的结果产生阳性，致病性测试 也产生典型症状.则判定为检出丁香假单胞杆菌豌豆致病型：一如果生化鉴定、DAS-ELISA检测或PCR的结果为阴性，则判定为未检出丁香假单胞杆菌豌豆致病型：一如果生化鉴定、DAS-ELISA或PCR检测中一种或一种以上方法的结果为阳性，而致病性测试为阴性，则应重新进行致病性测试.致病性重新测试后，如果仍然未产生典型症状，则判定为未检出丁香假单胞杆菌豌豆致病型.
8.2检测报告
检测报告应包含所采用检测方法所产生的数据，包括DAS-ELISA检测结果的吸光值数据报告、菌落形态特征照片、PCR检测的电泳图片或致病性测试结果的照片等.
