中华人民共和国国家标准
GB/T28081-2011
Detection and identification of tobacco ringspot virus
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口
本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：陈青、林石明、杨翠云、张毅、陈红运、廖富荣、郑云、李斌.
烟草环斑病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了烟草环斑病毒检疫鉴定的基本原则和方法.
本标准适用于可能携带烟草环斑病毒的种子、苗木、鳞球茎、组培苗等繁殖材料及其产品的检疫鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
SN/T1146植物检疫烟草环斑病毒检疫鉴定方法.
3烟草环斑病毒基本信息
中文名：烟草环斑病毒.缩写：TRSV.属虹豆花叶病毒科Comoviridae线虫传多面体病毒属Nepoviras病毒.TRSV的传播途径多样，可以通过种子、嫁接、机械接种和介体传播.烟草环斑病毒其他信息参见附录A.
学名：tobacco ringspot virus
4方法原理
利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）、体外反转录和体外DNA合成技术的反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）进行检测鉴定.
5仪器设备、用具及试剂
5.1仪器设备
洗板机、酶联检测仪、高速冷冻离心机、电子天平（感量0.001g）、超净工作台、旋涡混合仪、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、榨汁机、水浴锅，
5.2用具
微量移液器（0.5L2L，10yL，20gL，100pL，200gL，1000xL）、化学PCR反应管和（或）96孔光化学PCR反应板、酶联板、研钵.
5.3试剂
双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂（见B.1）.
反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测试剂（见C.1）.实时荧光RT-PCR检测试剂（见D.1).IC-RT-PCR 检测试剂（见E.1）.
6种苗的检测鉴定
6.1种子检测鉴定
挑取500粒种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播于灭菌土中，待长出3片～4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号，采集的叶片分成两份，分别用于酶联测定 和分子生物学检测.
也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测.
6.2苗木、组培苗检测签定
有症状的苗木单独检测.没有症状的分组检测，分组方法和检测方法同6.1.
6.3鳞球茎检测鉴定
取鳞球茎的小芽或鳞片进行酶联测定和分子生物学检测.
6.4植物产品的检测鉴定
植物产品有症状的部分单独检测.没有症状或无法的观察症状的植物产品，应按比例取样，检测方法为酶联测定和分子生物学检测.
7检测
7.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定
把制备的样品上清液加入已包被TRSV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测，每个样品平行加到两个孔中.健康的植物组织作阴性对照，感染TRSV的植物组织作阳性对照，样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料（如：种子或叶片）应尽量与检测样品相一致.
具体操作见附录B.
7.2RT-PCR检测
分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增，健康的植物组织作阴性对
照，感染TRSV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照.
具体操作见附录C.
7.3实时荧光PCR检测
分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行实时荧光PCR检测.健康的植物组织作阴性对照，感染TRSV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照.
具体操作见附录D.
7.4IC-RT-PCR检测
把制备的样品上清液加人已包被TRSV抗体的离心管中，然后进行IC-RT-PCR扩增.健康的植
物组织作阴性对照，感染TRSV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照.
具体操作见附录E.
8结果判定
7.1、7.2、7.3、7.4中如果两种方法的检测结果为阳性，即可判断该批种苗携带烟草环斑病毒.一般是酶联测定为阳性后，分子生物学检测为阳性即可判断为携带有烟草环斑病毒.必要时可进行生物接种试验，具体操作按照SN/T1146规定的方法执行.
9样品保存、结果记录与资料保存
9.1样品保存
经检验确定携带烟草环斑病毒的样品应在合适的条件下保存，种子保存在4℃，病株在一20C或者一80C冰箱中保存，做好标记和登记工作.
9.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、检测时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和检测人员的签字.酶联测定应有酶联板反应原始数据，RT-PCR检测应有扩增结果图片，生物学接种应有症状照片.
