中华人民共和国国家标准
GB/T28083-2011
Detection and identification of Ceratocystis fagacearum (Bretz）Hunt
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院.本标准主要起草人：严进、吴品珊、陈克、黄英、陈岩、段胜男、常雪艳.
栎枯萎病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了栎枯菱病菌的检疫鉴定方法，包括对栎属（QuercusL.）和栎枯萎病菌其他寄主的原本、本制品、本质包装和苗本的检疫.
本标准适用于对来自栎枯萎病发生国家和地区的标属植物和栎枯萎病菌其他寄主的检疫鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版（包括的修改单）适用于本文件.
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3栎枯萎病菌基本信息
核菌纲（Pyrenomycetes），球壳目（Sphaeriales），长喙壳科（Ophiostomataceae），长喙壳属（Ceratocyxtix 壳斗长喙壳[Ceratocyxtix fagacearum（Bretz）Hunt]属真菌界（Fungi），子囊菌门（Asycota），ElL &. Halst ).
栎枯菱病菌其他信息参见附录A.
4方法原理
标枯萎病菌的寄主范围、传播途径、植株症状（参见图B4）和病原形态（参见图B1、图B.2、图B3）是标枯萎病菌检疫鉴定方法的依据.
5试剂与标准菌株
5.1试剂
葡萄糖（CHOHO）、甲（苯）丙氨酸、磷酸二氢钾（KHPO）、硫酸镁（MgSO7HO）、硫酸铁[Fe（SO）zHO含量（以Fe计）21.0~23.0%]、硫酸锰（MnSO）、硫酸锌（ZnSO7HO）、维生素H（Vitamin H）、琼脂粉.
以上试剂除特殊注明外，均为化学纯.
5.2标准菌株
Ceratoc ystis fagacearum(Bretz） Hunt A1 和 A2 标准菌株.
1）来自美国的 Cerutoxystisjagarewrum（Bretz）Hunt A1和A2标准菌株保存于中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所.
6主要仪器设备
6.1仪器设备
立体显微镜、生物显微镜（具油镜和测微尺）、电子分析天平（感量0.001g）、普通天平（感量0.1g）、超净工作台、生物培养箱、高压灭菌器.
6.2试验用具
斧子、锯子、手持放大镜、培养Ⅲ、三角瓶（500mL）、试管（直径12mm）烧杯（1000mL）、手术刀、手术剪、镊子、载玻片、盖玻片、量筒、吸管、酒精灯.
7检疫与鉴定
7.1现场检疫
7.1.1样品抽取
按照SN/T 2122规定的方法.
7.1.2现场检疫
将抽取的原木或木制品或苗本用斧子或锯子分别横向和纵向切开，仔细观察横断面和纵断面有无黑福色条纹.如带皮，则要检查树皮和木质部之间是否有垫状菌丝层和边材上是否有传病媒介（参见附
将有症状样品带回实验室作进一步检验.
7.2室内检测与鉴定
7.2.1分离培养
采用麦芽浸出液酵母培养基或NFP培养基（见附录D)，用于病原菌的分离、培养形状测定和菌种保存.
在可疑发病的褐色条纹处取一块组织，切成4mm×4mm的小片，用0.5%NaOCl表面消毒5min，无菌水冲洗3遍，放在直径9cm的平板培养基上，每Ⅲ放4片～6片，于24C培养箱内培养黑 暗和光照各12h交替.7d后用显微镜检查.
若发现昆虫，首先需进行形态鉴定（参见附录C），如为露尾甲，则应检查是否携带栎枯萎病菌，方法是将其肢解，组织片用上述方法分离培养.
7.2.2形态观察
观察并记录培养基上生长菌落的形态特征.
从菌落中挑取少量培养物，以水作浮载剂，制成玻片，在显微镜下观察.如为Ceratocystisfagacearaamm的无性阶段，即可观察到分生孢子梗和分生孢子.详细记载分生孢子和菌丝的形态，记录并测量分生孢子梗、分生孢子大小.
用直径4mm的打孔器取菌落边缘的菌块2块，分别放在2个NFP培养基平板的一侧：用同法分别取标准菌株CeratocystisfagacearummA1和A2交配型的菌块各1块，分别放在上述平板培养基的另一侧，于24℃下培养7d~10d用立体显微镜观察同一平板培养基上的两菌落交界处是否产生子囊
GB/T 28083-2011
壳.挑取两菌落交界处产生的子囊壳制成玻片，于显微镜下观察.
如与A1交配型菌落交界处产生子囊壳，则待测菌株为A2交配型，如与A2交配型菌落交界处产生子囊壳，则待测菌株为A1交配型.
记载子囊壳、子囊和子囊孢子的形态特征并测量和记录子囊壳、子囊和子囊孢子大小.
8签定标准
8.1营养体形态
菌落呈绒毛状，厚1mm～3mm，初为白色，后为涉灰色至黄绿色，常有褐色斑块.
菌丝分枝有横隔，涉色至褐色，宽2.5μm~6.0gm，菌落中还能形成菌核，菌核茶褐色至黑色，质地疏松，形状不定，直径可达2.5cm.此外，还可形成一种橄榄色厚垣孢子.
8.2无性繁殖器官形态
基上可形成分生孢子链.分生孢子梗分枝或不分枝，宽2.5μm~5μm，长20μm~60μm，淡色至黑 分生孢子内生，无色，单胞，圆简形，两端平截，大小为（2μm~4.5pm）×（4μm~22μm），在培养色，有分隔，顶端逐渐变尖（参见图B.1）.
8.3有性繁殖器官形态
子囊壳单生或丛生，黑色，瓶形，基部球形，直径240μm~380μm，儿乎整个埋于基质内.子囊壳具有长喙，喙长250um~450um，顶端生有无色须状物（参见图B.2）.子囊球形至近球形，最大直径7μm~10m，内含8个子囊孢子.子囊孢子单胞，无色，椭圆形，微弯，大小为（2μm~3pm）×（5pm~10μm（参见图B.3）.子囊壁易消解，成熟后，子囊孢子从孔口流出，聚集在白色粘液中呈小滴状，在水中不易分散.
9结果判定
如形态鉴定结果与8.1、8.2、8.3 相符合，即可确定分离物为 Ceratocystix fagacearum（Bretz）Hunt
10样品保存
10.1菌种保存
分离获得的Ceratocystisfagacearumn菌种，应转人试管斜面，置于15℃黑暗条件下保存至少12个月，以备复验、谈判和仲裁.
10.2传病介体保存
捕获的传病昆虫除用于分离病原菌外，其余的应使其存活至检验鉴定完成，然后制成标本，尽量保持其身体各部位的完整性.
