中华人民共和国国家标准
GB/T28092-2011
Detection and identification of Botryosphaeria laricina (K.Sawada）Y.Z.Shong
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：吴翠萍、李彬、粟寒、高湖、陆军、吴品、刘伟、高振兴、安榆林.
落叶松枯梢病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了落叶松枯梢病菌 Botryosphaeria laricina（K.Sawada）Y.Z.Shong 1987 的检测和
鉴定方法.
本标准适用于对落叶松苗木、接穗以及带小枝梢的原木等样品携带落叶松枯梢病菌的检测和签定.
2落叶松枯梢病菌基本信息
中文名：落叶松枯梢病菌.
异名： Ph ysalospora laricina K. Sawada Guignardia laricina (K. Sawada) W. Yamamoto &.K. lto.
病害英文名：shoot blight of larch twig dieback of larch
采用Ainsworth（1973）真菌分类系统，病原菌为子囊菌亚门Asycotina，腔菌纲Loculoasy-cetes，格孢腔菌目Pleosporales，葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae，葡萄座腔菌属Botryosphaeria.
无性阶段为半知菌亚门Deuteromycotina，腔孢纲Coelomycetes，球壳孢目Sphaeropsidales，球壳袍科Sphaeropsidaceae，大签点霉属Macrophoma.
落叶松枯梢病菌的其他信息参见附录A.
3方法原理
根据病原菌危害的症状特点（参见附录B）采集样品进行检测，观察病原菌产生的子实体的显微形态特征，并结合病原菌的地理分布和寄主范围等有关信息进行结果判断.
4位器和用具
4.1仪器
体视显微镜、普通光学显微镜（具显微拍摄和测量功能）、光照培养箱、高压灭菌器、干热灭菌器、冰箱等.
4.2用具
手持放大镜、试剂瓶、纱布、脱脂棉、镊子、剪刀、培养Ⅲ、修枝剪、吸管、酒精灯、打孔器（直径5mm）、瓷盘、解剖刀、酒精灯、解剖针、载玻片、盖玻片、微量移液器、标本盒、海绵、胶带、标签等.
5试剂
石蜡，70%、95%酒精，二氧化硅干燥剂.
6检测
6.1样品采集
固着的白色滴状物树脂块；干枯的枝干部为紫褐色或灰褐色：在枯死的枝干、松针上有突出的枯梢病原 根据下列症状等进行样品采集：苗木、接穗上的新椭枯死，并且枯死的椭端呈弯曲状：在病组织上有菌子实体.原木上如果带有的小枝梢，则应仔细观察小枝梢上有无子实体，若无，则可排除怀疑带有枯精病原菌，
6.2样品制备
6.2.1子实体的制片
片，在解剖镜或显微镜下观察子实体的形态并确认是否成熟，如果成熟，则观察典型形态特征并测量大 用解副针挑取样品上的子实体少许，置于载玻片上加盖玻片压碎或由发病部位直接切片制成水玻小：如果不成熟则需进一步培养.
6.2.2不成熟子实体的培养
变温处理，每次5min，重复1次，再浸在无菌水中30min，最后取出置室温条件下保湿培养中7d~12d， 对子实体不成熟的部位，先用无菌水浸泡2d~3d，然后浸泡在35℃和10℃的无菌水中进行交替诱导产生成熟子实体并制片镜检.
7签定
7.1有性阶段子实体形态特征
子囊座为壳状、瓶状或梨形，黑褐色，单生、2个～5个群生或丛生在病枝表皮下，成熟后仅孔口外露，大小为（170μm~500pm）×（130μm~300pm）.子囊棍棒状，双壁，无色，顶端圆，下有短柄，平行排列于子囊腔基部，大小为（115μm~149μm）×（20μm~45gm）.假侧丝很多，线形，无色，半永久存在，直径3pm.子囊孢子8个.双行排列，椭圆形至纺锤形，单胞，无色，大小为（22.5μm~40gm）×（6.3μm~15 5 μm）.参见附录 C.
7.2无性阶段子实体形态特征
分生孢子器群生于顶梢残留的叶背和顶稍小枝周围的表皮下，并使表皮突起，近球形或扁球形，黑色，大小为（120cm~249μm）×（148μm~213pm）.分生孢子梗短，不分枝，圆柱形，（5μm~7pm）X（2.5μm~3.2μm）.分生孢子椭圆形至纺链形，单胞，无色，大小为（24μm~30μm）×（6μm~9μm）. 常见1~2个油球.参见附录C.
性孢子器球形至扁球形，单个或儿个丛生于病枝表皮下，大小为（115μm~214pm）×（109gm~190μm）.性孢子梗细长，无色，2个~3个分隔，大小为（12μm~16μm）×（3jm~5μm）.性孢子短杆状或椭圆状，无色.大小为（3μm~6μm）×（1μm~2μm）参见附录C.
8结果判定
如有性阶段、无性阶段的形态特征符合第7章鉴定特征的描述，即可判定为落叶松枯梢病菌.
9标本和样品保存
发现落叶松枯梢病菌的样品，需制作成标本在室温条件下进行干燥保存，或将样品置于一20C冷冻保存，保存至少6个月，以备复检、谈判和仲裁.保存期满后进行灭活处理.
