中华人民共和国国家标准
GB/T28094-2011
Detection and identification ofXanthomonas campestris pv.mangiferaeindicae (Patel et al.）Robbs et al.
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：刘鹏、罗加风、崔汝强、魏亚东、王金成、刘勇、赵立荣、黄国明.
芒果细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了芒果细菌性黑斑病菌的检疫鉴定方法.本标准适用于芒果果实、苗木等植物材料中芒果细菌性黑斑病菌的检疫和鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
SN/T1193基因检验实验室技术要求SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3芒果细菌性黑斑病菌基本信息
中文名：芒果细菌性黑斑病菌.
学名 ： Xanzhomona.s cam pestris pv. mangiferaeindicae ( Patel Moniz &. Kulkarni 1948) Robbs Ribeiro &. Kimura 1974.
病害英文名：mango bacterial black spot.
属细菌界Bacteria，变形细菌门 Proteobacteria，Y-变形细菌纲Gammaproteobacteria，黄单胞菌目Xanthomonodales，黄单胞菌科Xanthomonodaceae黄单胞菌属Xamhomonas.
病菌潜伏在病叶、病枝条、病果等组织内越冬，是主要的初侵染源.病菌借风南、流水和接触传播，远距离传播主要是带菌苗木、接穗和果实等.
芒果细菌性黑斑病菌的其他信息参见附录A.
4方法原理
测鉴定. 依据症状特征，以及该病菌的生物学特性、生理生化特性、分子生物学特性和致病性特征等进行检
5仪器用具
生物显微镜、超净工作台、高压灭菌器、恒温培养箱、离心机（12000r/min）、分光光度计、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仅、电子天平（感量0.0001g）、恒温水浴锅、恒温光照培养箱、低温冰箱、微量可调加样器(10μL100μL、200μL1 000μL)等.
6试剂和培养基
6.1试剂
MgCl，dNTPs（dATPdTTP、dCTP、dGTP)，Tag酶，氧化酶试纸条，细菌微量生化鉴定管，引物
GB/T 28094-2011
XgyrconpcrF1，Xgyrconrpcrl，Xgyrconfsp1等购自生物公司.
除另有规定外，试剂均为分析纯，试验用水均为灭菌双蒸水.
6.2培养基
NA培养基，半选择性培养基NCTM3和KC见附录B.
7检疫签定方法及步骤
7.1现场检疫
芒果种植园的病害调查或进出境芒果样品的现场检疫中，若芒果植株或果实病害症状表现与附录A中描述类似，取样带回实验室做进一步分离鉴定，取样方法和步骤参照SN/T2122.
7.2病原菌分离
病组织放人无菌水中，并用灭菌玻棒研碎，10min后用接种环蘸取，在半选择性培养基NCTM3或KC 选择较新鲜的发病组织，切取病健交界部位，用无菌水清洗三次.在培养血中滴入儿滴无菌水，将平板上划线分离，做不少于3个平板，置于28℃下，NCTM3培养基培养5d~6d，KC培养基培养4d~5d后观察，Xcm在这两种培养基上菌落特征相似，直径3mm~4mm，圆形，轻微凸起，边缘整齐，白色或乳白色（少见黄色），黏液状.
基上进行分离纯化. 挑取可疑单菌落点接在氧化酶试纸条上，选择60s内不变色的单菌落（排除假单胞菌）在NA培养
7.3分子生物学鉴定（PCR方法）
分子生物学检测中安全措施方面要求按照SN/T1193.
纯化后的菌株经28C培养24h后，制备模板DNA，扩增gyrB基因，用无菌双蒸水代替模板做空白对照，扩增目的片段大小约为700bp.PCR产物回收后测序，测序结果与GenBank数据库中的已知模式菌株序列进行比对，该检测方法见附录B.
7.4生化指标测定
采用生化鉴定管对可疑菌株和芒果细菌性黑斑病菌标准菌株进行下列指标的检测，包括硝酸盐还原，七叶灵水解，尿酶产生，HS产生，淀粉水解，明胶液化，阿拉伯糖、纤维二糖、半乳糖和果糖发酵，叫噪产生，精氨酸双水解.
胶液化阳性，能从阿拉伯糖、纤维二糖、半乳糖和果糖产酸，吲噪产生阴性，尿酶阴性，精氨酸双水解 Xcm生化指标检测结果应为硝酸盐还原阴性，七叶灵水解阳性，HS产生阳性，淀粉水解阳性明阴性.
7.5致病性测定
24h的菌株用无菌水配成约为10CFU/mL的菌悬液接种.用无菌水作阴性对照，芒果细菌性黑斑病 针刺接种苗木在温室或田间进行，离体叶片法接种在室内平Ⅲ保湿进行.取在NA培养基上培养菌标准菌株作阳性对照.接种后的苗木保持湿度90%：离体叶片置培养Ⅲ中，叶柄用浸有50×106-苄氨基嗪呤（6-BA）培养液的脱脂棉保湿，温度白天30℃，晚上26℃，光照12h.接种9d后观察是否出现水渍状病斑.
8结果判定
分离纯化得到的细菌菌株同时符合以下三个方面的检测结果，则可以判定检出Xcm.
a）在半选择性培养基上的菌落特征与描述相符：b）生理生化测定结果与描述相符：c）PCR扩增产物测序结果与已知Xcn的gyrB基因同源性在98%以上；或致病性测定表现典型症状.
9样品保存
检出Xcmn的样品至少保存6个月，以备复检、谈判和仲裁：保存期满后，需经灭菌后方可处理.
10菌种保存
分离并最终鉴定为Xcrmn的菌株应转接到NA培养基试管斜面上，经登记和经手人签字后置于4℃低湿冰箱中保存，30d~60d转接一次，以防止病菌死亡，以备复核、谈判和仲裁.必要时将菌株用真空 冷冻干燥机冻干后长期保存.
