中华人民共和国国家标准
GB/T28095-2011
Detection and identification of Phellinus noxius(Corner)G. Cunn.
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：张建成、陈先锋、丁国云、张慧丽、戴忠军、张培、王良华.
木层孔褐根腐病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了本层孔褐根腐病菌Phelfinusnoxias的检疫鉴定方法.本标准适用于本材和苗木上的木层孔福根腐病菌的检测和鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T12728食用菌术语SN/T1126进出境木材检疫规程SN/T1157进出境植物苗木检疫规程
3术语和定义
GB/T12728界定的以及下列术语和定义适用于本文件.
3. 1
平伏反卷effused-reflexed
菌盖，有时呈覆瓦状叠生.整个担子果贴附于基物上，不形成菌盖的形态称为平伏（effused）. 担子果在基物上的着生形态，其一部分贴附于基物上，边缘翘起反卷形成檐状、条状、半圆形或扇形
3. 2
生殖菌丝generative hyphae
担子果中基本的菌丝类型.在刺革菌科（Hymenochaetaceae）种类中，生殖菌丝只形成简单分隔，不形成锁状联合，通常无色、浅黄色或浅黄褐色，薄壁或厚壁，分枝或很少分枝.
刚毛状菌丝setal hyphae
在菌肉或菌髓中形态像菌丝，但明显比菌丝宽，且具有厚壁，顶端尖锐的结构.
4木层孔褐根腐病菌基本信息
中文名：本层孔褐根腐病菌.
学名 :Phelfinus no.xius (Corner)G. Cunn. 1965 .
病害英文名：brown root rot disease.
属真菌界Fungi，担子菌门 Basidiomycota.担子菌纲 Basidiomycetes，刺革菌目Hymenochaetales，刺革菌科Hymenochaetaceae，木层孔菌属Phellinus.
本层孔褐根腐病菌的其他信息参见附录A.
5方法原理
根据木层孔褐根腐病菌在寄主植物上的症状，抽取可疑样品进行病原菌分离培养，根据病原菌的形态特征、生物学特征和PCR特异性反应对病菌进行鉴定.
6位器和用具
6.1仪器设备
体视显微镜、显微镜（具100×油镜和测微尺）、超净工作台、生物培养箱、冰箱、高压灭菌器、干热灭菌器.
6.2实验用具
载玻片、盖玻片、滴管、培养Ⅲ、镊子、解剖刀、酒精灯、医用手术剪.
7试剂和材料
7.1试剂
7.1.1蒸馏水(H:0)，7.1.25%氢氧化钾（KOH）溶液（质量浓度）.7.1.4Melzer 试剂：碘（1）0.5 g、碘化钾（KI)1.5 g、水20g、水合氯醛22.5g. 7.1.3棉蓝试剂：棉蓝（苯胺蓝）0.5g、乳酸60ml.
7.2培养基
7.2.1大麦提取物琼脂（MEA）培养基
大麦提取物（MaltExtract）20g，琼脂（Agar）20g加蒸馏水至1000mL.121C高压湿热灭菌30 min，倒平板备用.
7.2.2选择性培养基
MEA培养基灭菌后.待冷却至40℃~50℃，加人100mg氨苄青霉素，10mg氯硝胺，10mg苯菌灵，500mg没食子酸，混匀倒平板.
7.2.3马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基
自行配制或使用市售PDA培养基.
8现场检测
取样和抽样按照SN/T1157或SN/T1126方法进行.
取样时应进行针对性检查，检查有无可疑症状，重点观察茎干基部1m范围内区域及根系是否包裹褐色菌丝层；剥去树皮，观察树木组织是否白色腐朽，有无褐色网纹状菌丝束；腐烂树木表面是否有真菌子实体.直接挑出带有可疑症状的货物，将可疑部分切（锯）下，送实验室作进一步检验鉴定.
9实验室检测
9.1分离和培养
约3mm×3mm×6mm小块，置于选择性培养基平板上，每个培养Ⅲ放置5块，梅花状排列.30C黑暗 将带病材料用自来水冲洗干净，活净吸水纸吸干.去除树皮，用消毒的解剖刀片将内部病组织切成培养5d~10d.选择性培养基上的福色菌落转移到MEA培养基或PDA培养基30℃黑暗培养.长满平板后，检查培养性状，在光学显微镜下观察菌丝形态特征.
9.2子实体观察
如发现病菌子实体，采用宏观形态观察和显微切片方法检测.
宏观形态观察使用体式显微镜，观察子实体的形态、色泽、菌盖、菌孔等特征.
做为浮载剂，在显微镜下观察菌丝及子实层中的担孢子、担子、菌髓等微观特征.显微测量和摄像均在 显微切片检测方法，使用干标本制作成徒手切片，以蒸馏水、Melzer试剂和5%氢氧化钾溶液分别棉蓝试剂包埋的切片中进行.孢子测量30个，其他结构如菌丝直径、担子大小等均测量10个，取极小值与极大值，宽度测量于其结构的最宽部位，长度测量于其顶端至基部分隔处.
9.3PCR检测方法
培养物菌丝或病组织中病菌DNA提取和PCR检测方法见附录B.
引物PN-1F/PN-2R扩增病菌DNA，得到414 bp或422bp 扩增产物，则为PCR检测阳性，反之，为阴性.真菌DNA均可与通用引I物ITS-1和ITS-2结合扩增产生300 bp左右的DNA片段.
10鉴定特征
10.1寄主上症状
泥沙结合不明显.潮湿时，茎部菌丝壳的延伸边缘乳白色，约2cm宽，带有澄清褐色的渗出液滴.（参 树木根和茎基部表面多形成一层厚厚的黑褐色到黑色菌丝壳，坚硬，油浸状表面，根部菌丝壳常与见图C.1）树皮易剥落，病害引起软面脆的蜂窝状白色腐烂，受感染树皮内侧组织具不规则暗褐色菌丝束形成的网纹（参见图C.2）.
10.2无性阶段特征
10.2.1培养性状
在含有没食子酸MEA培养基上，能产生扩散性的暗褐色色素.菌落不规则，菌落前缘菌丝气生至平伏，初始白色至草黄色，渐渐转为黄褐色至褐色，有褐色网纹（参见图D.1）.
10.2.2显微特征
菌丝透明到褐色，不产生锁状联合，一般能够产生节孢子和毛状菌丝.节孢子（参见图D.2）由菌丝断裂形成，与菌丝同色，球形到卵形.毛状菌丝（参见图D.3）鹿角状，菌丝分叉生长，表面有剩状突起.
10.3子实体形态
10.3.1整体特征
子实体单生，无柄，大小不一，平伏或平伏反卷形成窄的菌盖（参见图C.3和图C.4），长可达10cm，
