T/SAASS
T/SAASS341-2026
盐碱地水稻根际促生菌分离与保藏技术规 程
Technical code of practice for isolation and preservation of rice rhizosphere growthpromoting bacteria in saline-alkali soil
山东农学会 发布
前言
起草. 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由山东省农业科学院提出.
本文件由山东农学会归口.
本文件起草单位：山东省农业科学院、施可丰化工股份有限公司、山东爱福地生物股份有限公司、赤峰市农牧技术推广中心、山东种业智科农业科技服务有限公司.
本文件主要起草人：宣宁、陈高、邵亚会、耿耘、张樱馨、边斐、杨文龙、康佳、山东廷、苑喜军、巩俊花、魏祥圣、赵红军、解晓梅、李鹏、查娜，鲍新玥，聂大杭.
盐碱地水稻根际促生菌分离与保藏技术规程
1范围
档的技术流程. 本文件规定了盐碱地水稻根际土壤样品采集以及促生菌分离、纯化、功能鉴定、菌种保藏及记录建
本文件适用于盐碱地水稻根际促生菌分离、筛选、鉴定与保藏.
2规范性引用文件
仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，文件.
GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T46408-2025微生物资源机构数据管理及发布规范NY/T1121.1土壤检测第1部分：土壤样品的采集、处理和贮存NY/T1121.2土壤检测第2部分：土壤pH的测定 NY/T1121.16土壤检测第16部分：土壤水溶性总盐量的测定NY/T1736-2009微生物肥料菌种鉴定技术规范
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
水稻根际rhizosphereof rice
水稻根系周围、受根系活动强烈影响的微域土壤环境，通常指距根表数毫米范围内的土壤.
根际促生菌plantgrowthpromotingrhizobacteria
放线菌、丝状真菌、酵母菌、蓝藻等在内的根际微生物. 能够直接或间接促进植物生长、增加作物产量、防治病虫害、且能在水稻根系稳定定植的包括细菌、
4仪器与试剂
4.1主要仪器
高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温振荡培养箱、恒温培养箱、pH计、光学显微镜、PCR仪、电泳仪、冷冻离心机、-80℃超低温冰箱、液氮罐、原子吸收光谱仪、分光光度计等.实验室生物安全条件 应符合GB19489的要求.
4.2主要试剂
培养基：LB培养基、R2A培养基、硅酸盐培养基、有机磷水解培养基、无机磷水解培养基、阿须贝无氮培养基、CAS检测培养基、ACC脱氨酶检测培养基（含ADF培养基和DF培养基）、产IAA检测培养基等，所用试剂纯度应为化学纯或以上.相关培养基配方参见附录A.
5操作流程
图1盐碱地水稻根际促生菌分离与保藏操作流程
6技术要点
6.1样品采集
6.1.1采样时间
于水稻分盛期或抽穗期进行.
6.1.2采样方法
电导率EC值衡量）和碱度（用pH值衡量）来综合判断土壤类型并调整根团采集深度：对于重度盐碱地（EC 选择长势均匀的植株，按“S”形或五点法进行取样.在盐碱地取样时，需同时依据土壤的盐度（用>0.8dS/m或pH>9.0），采集深度为5cm~10cm：对于中度盐碱地（EC0.4dS/m~0.8dS/m或pH值8.0~9.0），采集深度为3cm~5cm：对于轻度或非盐碱地则可按常规采集.若土壤同时存在盐化与碱化，以 更高的危害等级为准.用铲子挖出完整根团，立即存放于4C冰盒中运回实验室，在超净工作台内用灭菌刀片刮取根表0mm~4mm的土壤作为根际土样.操作按照NY/T1121.1的规定执行.
6.1.3样品记录
详细记录样品编号、采集地点、采集时间、土壤盐度、土壤碱度、土壤盐分组成类型以及水稻品种等信息.其中，土壤盐度测定应按照NY/T1121.16的规定执行：土壤碱度测定应按照NY/T1121.2的规定执行.对于土壤盐分组成类型，例如氯化物型或硫酸盐型等，应在条件允许的情况下尽可能测定并记录.
6.1.4样品贮存
采集的样品应立即放入4C冰盒中转运，并于24h内处理完毕，或于-20C短期保存.
6.2促生菌的分离与纯化
称取10g根际土样，加入90mL适宜的无菌稀释液，于28C、180r/min条件下振荡30min.稀释液应选择与采样地土壤盐度接近的无菌盐水溶液，例如0.85%NaC1的无菌生理盐水、1%~3%的NaC1溶液，或根据土壤电导率EC值进行配制.对于放线菌，需先将土壤样品55C热处理6min~10min或2%苯酚处理.
6.2.1梯度稀释
取上清液进行10倍系列梯度稀释（10至10”）.
6.2.2分离培养
基上，其培养基选择需依据目标微生物类型面定：细菌使用R2A或LB培养基，放线菌使用高氏一号培养 采用涂布法或划线法，将100uL各浓度稀释液接种于含不同NaC1浓度梯度与不同pH梯度的分离培养基，丝状真菌使用PDA或察氏培养基，酵母菌使用YPD培养基，蓝藻使用BG-11培养基：接种时根据采样地土壤的实际盐度与碱度，组合选择与之匹配的NaC1浓度与pH值进行双重筛选，每个盐度与碱度的条件 组合需设置3个重复，并于25℃~30C倒置培养.
6.2.3纯化
挑取不同形态的单一菌落，进行多次划线纯化，直至获得纯培养物.
6.2.4菌株形态鉴定
根据所纯化菌株的类别进行形态观察：
a)细菌：观察菌落形态，并进行革兰氏染色镜检，观察菌体细胞形态、大小、颜色、质地、光泽b）放线菌：观察菌落的大小、形状、表面状况、气生菌丝和基内菌丝的额色及可溶性色素，通过 等，是否有荚膜、是否形成芽孢等：插片法在显微镜下观察气生菌丝、孢子丝的形态：d）酵母菌：观察菌落大小、形状、质地、颜色等，并制成水浸片观察细胞形态和无性繁殖方式： c）丝状真菌：观察菌落质地、颜色、生长速度、色素等：e)蓝藻：观察菌落形态、颜色、质地等，并制成水浸片在显微镜下观察藻丝形态、细胞排列、有无异形胞、厚垣孢子等特征.
6.3遗传特性鉴定及分类学地位鉴定
对纯化菌株进行基因测序分析，所用引物应包含以下范围：
a）细菌、蓝藻与放线菌：扩增16SrDNA序列，引物对按照NY/T1736-2009附录D（27F/1492R）：b）酵母菌：扩增26SrDNA D1/D2区域或ITS序列，引物对按照NY/T1736-2009附录D（NL-c)丝状真菌：扩增ITS序列或18SrDNA序列，引物对按照NY/T1736-2009附录D（ITS1/ITS4 1/NL4 或 ITS1/ITS4).或NS1/NS8）.
参考，并结合系统发育树确定其分类学地位. 将测序结果在NCBI、EzBioCloud等数据库中进行比对，通常将序列相似度≥98.5%作为同种的重要
6.4促生潜能筛查
6.4.1耐盐性鉴定
