中华人民共和国国家标准
GB/T28236-2011
Method of chromosome aberration analysis forbiological dose assessment
中华人民共和国卫生部 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准代替GB/T12715-1991（染色体畸变分析估算生物剂量的方法》.本标准与GB/T12715-1991相比主要变化如下： 补充了标准的范围“也适用于一次比较均匀的全身外照射复合烧伤的病例的生物剂量估算”：一将可较准确估算剂量的取血时间改成60d：一强调采用培养开始加秋水仙素法和用dic（或"dic十r”）估算剂量；一增加了不均匀和局部照射的统计检验和生物剂量估算方法： 原标准基本是引用1AEA第260号技术报告丛书（1986），本标准尽量采用我国的资料，如染色体畸变图、生物剂量估算的举例、某些统计分析方法、取血有效时间和估算剂量的注意事项等.同时，也参考和引I用了1AEA第405号技术报告丛书（2001）的有关内容.本标准附录A是规范性附录，附录B是资料性附录.本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口. 本标准起草单位：中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所.本标准主要起草人：白玉书.本标准由中华人民共和国卫生部负责解释.本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T12715-1991.
染色体畸变估算生物剂量方法
1范围
本标准给出了电离辐射诱发人外周血淋巴细胞染色体畸变的剂量-效应曲线的建立和用其估算生物剂量的方法.
本标准适用于一次比较均匀的全身外照射事故受照人员的剂量估算.
本标准也适用于一次比较均匀的全身外照射复合烧伤的病例剂量估算.
本标准不适用于分次照射、长期小剂量累积照射和内照射的生物剂量估算.
2术语和定义
下列术语和定义适用于本标准.
2.1
生物剂量计biologicaldosimeter
系，从而可用来推定受照剂量. 用以估算受照剂量的生物体系，该生物体系受到照射后的反应与受照剂量之间存在着某种定量关
2.2
剂量-效应曲线dose-response curve
某种物质或生物体系受到照射后的反应与受照剂量之间存在着某种定量关系，可将二者拟合成适当的数学模式，并制备出相应的刻度曲线，称之为剂量-效应曲线，可用其估算受照剂量.
2.3
染色体chromosome
基因的载体.存在于细胞核内，当细胞分裂时，在碱性染料作用下着色较深.由脱氧核糖核酸（DNA）、蛋白质和少量核糖核酸（RNA）组成.
2.4
染色体畸变chromosome aberration
正常染色体在物理、化学或生物等因素作用下发生的结构和数目上的异常.
2.5
染色体型畸变chromosome-type aberration
的畸变，经S期复制后，形成涉及两条单体的染色体型畸变，主要包括无着丝粒断片、微小体、无着丝粒 照射时处于Go或G：期的细胞，由于在DNA合成之前，染色体以一条单体行使其功能，这时诱发环、着丝粒环、双或多着丝粒体、倒位、易位、插人和缺失等.
2. 6
染色单体型畸变chromatid-type aberration
在S期受照的大多数细胞和G期受照的细胞，已进行DNA合成，即已形成两个独立的单体，所以只诱发染色单体型畸变，主要包括染色单体断裂、染色单体互换、染色单体间隙和等染色单体间隙等.2. 7
非稳定性染色体畸变包括无着丝粒断片、微小体、无着丝粒环、双着丝粒体和着丝粒环.
无着丝粒断片、微小体、无着丝粒环，由于无着丝粒，在纺锤体上不能定向，很快从分裂细胞中丢失.双着丝粒体和着丝粒环往往在分裂后期形成染色体桥或导致四倍体而常引起细胞死亡，将上述五种畸
变称为非稳定性畸变，
2. 8
稳定性染色体畸变stable chromosome aberration
倒位、易位、插入和缺失等畸变，在细胞分裂时不存在任何力学上的障碍，细胞复制不受影响，可较长时间在体内存在，称之为稳定性畸变.
3试剂配制、细胞培养和标本制备
3.1试剂配制
3.1.1培养液配制
3.1.1.2于上述培养液中加人抗生素，其终浓度为：青霉素100IU/mL，链霉素100IU/mL.
3.1.1.4加人灭活的新生牛血清200mL使其浓度占培养液总量的20%.
3.1.1.5将上述培养液充分混匀后，分装到灭菌的培养瓶中，每瓶4mL，置人一20C低温冰箱保存备用.
3.1.20.2%肝素溶液
称取200mg肝素钠粉溶于100ml生理盐水中，55.12kPa灭菌15min.
3.1.3秋水仙素溶液（分子式：CHON，分子量：399）
称取秋水仙素100mg，溶于100mL生理盐水（1mg/mL）即为原液，分装成小瓶，低温保存.应用时配制成 2. 5yμg/mL.
3.1.4PHA干粉
按使用说明配制.
3.1.50.075mol/LKCI低渗液
称取5.60gKC1溶于1000mL.去离子水中，放人37℃恒湿箱中备用.
3.1.6Giemsa染液
0.5 g甲醇（AR） 中性甘油（CP) 33.0 mL 33. 0 mL
先将Giemsa染料放人乳钵中，加甘油后研磨片刻，移人小烧杯内，放置55℃~60C水浴箱中2h，用玻璃棒搅拌，溶解后加人33mL甲醇即为原液，用前按Giemsa！PBS=1：20稀释.
3.2细胞培养和标本制备
3.2.1培养开始加秋水仙素法
3.2.1.1将冰冻保存的培养液取出，室温下融化.
3.2.1.2用肝素溶液湿润灭菌注射器后，抽取静脉血于每瓶组合培养液内加人0.4mL抗凝血，平行接种2瓶，对过量受照者的样品接种不少于3瓶.根据有关信息，估计受照剂量较大（>5Gy）者，接种不少于6瓶，
3.2.1.3加人PHA，加入量按使用说明确定.
3.2.1.4加人秋水仙素，最终浓度为0.04jg/ml.
3.2.1.5混匀.标记姓名、日期，置人37℃恒湿箱培养.
3.2.1.2~3.2.1.5的操作必须在无菌条件下进行.
3.2.1.6培养48h~50h，取出培养瓶，去上清液.
3.2.1.7加人0.075mol/LKCl低渗液8ml，混匀，低渗10min.
3.2.1.8加人固定液（甲醇：冰乙酸=311)1mL预固定.
3.2.1.91000r/min离心10min，去上清，再加固定液8mL，混匀.3.2.1.10固定20min，再离心10min，去上清，重复固定一次.3.2.1.11冰干法制片，每片滴3滴沉淀物，过火一燃即可. 3.2.1.12干燥后Giemsa染色.3.2.2荧光加姬姆萨（FPG）技术3.2.2.1将冰冻保存的培养液取出，室温下融化.3.2.2.2用肝素溶液湿润灭菌注射器后，抽取静脉血，于每瓶组合培养液内加人0.4mL抗凝血，平行 接种2瓶，对过量受照者接种不少于3瓶，对估计受照剂量较大（>5Gy）者，接种不少于6瓶.3.2.2.3加人PHA，加人量按使用说明确定.3.2.2.4加 Brdu（5-溴脱氧尿嘧啶核苷），最终浓度为15μg/mL.3.2.2.2~3.2.2.4的操作必须在无菌条件下进行.3.2.2.5混匀，标记姓名、日期，置人37C恒湿箱避光培养46h加秋水仙素，继续培养至48h~50h 收获.3.2.2.6制片后用荧光染料处理.将标本浸人浓度为2.5pg/mL的Hoechst33258溶液（避光），40 min后用蒸馏水冲洗.灯照射30min 3.2.2.7晾干后往标本上滴加2×SSC溶液，标本所在玻璃板温度为50C～60C，用黑光灯或紫外线3.2.2.8晾干后Giemsa染色.
4剂量-效应曲线的建立方法
4.1照射条件和培养方法
4.1.1必须提供可靠的、明确的样品照射的物理剂量，受照标本应与照射源保持一定的距离以达到均匀照射的目的.有条件的实验室应建立包括不同辐射类型（如X射线、Y射线、中子）、不同剂量率（低LET辐射>的剂量-效应曲线.在0.1Gy~5.0Gy剂量范围内，剂量率最好大于0.3Gy/min，小于 1.0Gy/min，至少要选择8个剂量点.4.1.2选择2~3名成年健康人血样，在37C土0.5℃条件下进行离体照射，照后在上述温度下放置2h，然后采用培养开始加秋水仙素法或FPG技术培养，得到可供分析的第一次有丝分裂（M）细胞，如
果采用前种方法，其秋水仙素浓度对分裂中期细胞的有效阻断率必须达到99%以上.
4.2计数分析技术
4.2.1在分析M细胞时，只记录染色体型畸变中的非稳定型畸变：
a）无着丝粒畸变（acentrics，ace）是一对无着丝粒的組妹染色单体，包括无着丝粒断片、微小体和无着丝粒环.无着丝粒断片（acentricfragments，f），又称末端缺失，是一对相互平行的染色单体，有时易与等染色单体间隙相混淆，其判断标准是：如果两断端距离小于染色单体横径，视为 等染色单体间隙，否则为无着丝粒断片：微小体（minutes，m），又称中间缺失，为一对比无着丝粒断片小得多的染色单体，呈现一对染色质球状；无着丝粒环（acentricrings，ar）也称中间缺失，是一对环形的无着丝粒染色单体.b）着丝粒环（centricrings r）是一对具有着丝粒的环形染色单体，常伴有一对无着丝粒断片. c）双着丝粒体（dicentric，dic）是指有两个着丝粒的染色体，常伴有一对无着丝粒断片，多着丝粒体是指具有三个或三个以上着丝粒的染色体，如三着丝粒体（tricentric，tri>伴有两对无着丝粒断片，四着丝粒体（quadricentric，quadri）伴有三对无着丝粒断片.三着丝粒体计算成两个双着丝粒体，四着丝粒体计算成三个双着丝粒体，即三着丝粒体以上的，应计算成a一1个双着丝粒体.
在土述畸变中，双着丝粒体是估算生物剂量的最佳指标，也可将其与着丝粒环合并（双十环，dic十r）估算剂量，无着丝粒畸变是估算剂量的辅助指标（dic和r图见附录A）.
