中华人民共和国国家标准
GB/T 28978-2012
马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Clavibactermichiganensis subsp.sepedonicus
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口
本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国福建出人境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局.
本标准主要起草人：廖富荣、林石明、吴媛、沈建国、吴志毅、陈青、张明哲、陈红运、黄蓬英.
马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了基于生理生化特性、致病性特征、血清学、分子生物学特征的马铃薯环腐病菌检测和鉴定方法.
本标准适用于马铃薯环腐病菌在马铃薯块茎、植株上的检测与鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
SN/T1135.5-2007马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法
3马铃薯环腐病菌基本信息
中文名称：密执安棒状杆菌环腐亚种
俗 名：马铃薯环腐病菌
拉T学名：Clavibacter michiganensis subsp se pedonicas
属于微杆菌科（Microbacteriaceae）棒形杆菌属（Clavibacter）的成员.
马铃薯环腐病菌（以下简称Cms）引起马铃薯环腐病，可通过带病的种薯进行远距离传播，也报道可通过番茄等种子传播，关于Cms的其他信息参见附录A.
4方法原理
马铃薯环腐病菌具有独特的培养性状和生理生化特征，该病菌的生理生化特性、致病性特征，以及血清学、分子生物学特征是制定本标准的主要依据.
5主要仪器设备
本标准的检测鉴定方法主要使用以下仅器设备：
微量榨汁机、酶标仪、洗板机、微量天平（感量：0.001g）、生物培养箱、荧光显微镜、PCR仪、荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、BIOLOG自动微生物鉴定系统、浊度计、水浴槽或恒温孵育器、pH计、各种量程的可调移液器（1000yL、200pL、100pL、20L、10zL、2L）.
6检测与鉴定
6.1症状检查
马铃薯环腐病菌侵染马铃薯植株后在马铃薯块茎、植株上可产生症状（参见附录A），通过症状检查可以初步判断是否为Cms引起的病害.
GB/T 28978-2012
6.2表现症状样品中病原菌的分离
6.2.1培养基的选择
从马铃薯块茎、茎杆、叶片等植物组织中分离病原菌选择用MTNA培养基（见B.1)或NCP-88培养基（见B.2），用酵母葡萄糖矿物盐培养基（YGM）（见B.3）或葡萄糖营养琼脂（NDA）（见B.4）进一步纯化.
6.2.2分离纯化
按附录C给出的方法，从发病的植物组织中分离病原菌.当分离到疑似Cms的纯培养后，按6.4~6.6给出的方法进行鉴定，然后按6.7给出的方法进行致病性测定.
6.3潜伏侵染样品初筛与分离
6.3.1样品制备
按附录D的给出的方法，每份检测样品取200个马铃薯块茎，洗涤去除表面土壤后，切取维管束组织制备马铃薯块茎悬浮液.
6.3.2初筛检测
利用DAS-ELISA方法（按6.5给出的方法）对制备马铃薯块茎悬浮液进行初筛检测.如果DAS-ELISA检测结果为阳性的，则用RT-PCR方法（按6.6.1给出的方法）进行验证，
6.3.3生物学测定
把初筛检测阳性的马铃薯块茎悬浮液接种到感病的茄子上，进行生物学测定（按6.7给出的方法）.
6.3.4分离纯化
按附录C给出的方法，把初筛检测阳性的马铃薯块茎悬浮液进行系列稀释（10、10"、10”），分别取100μL涂布到MTNA培养基（见B.1）或NCP-88培养基中（见B.2）上进行分离培养.
对疑似Cms菌落按6.4~6.6给出的方法进行鉴定，然后按6.7给出的方法进行致病性测定.
注：分离纯化可以和生物学测定平行进行.
6.4BIOLOG墓定
按附录E给出的方法，把疑似Cms的纯培养接种到BUG培养基（见B.7）上富集培养，然后接种到GENⅢ鉴定板上进行鉴定.
6.5 DAS-ELISA 检测
对于表现症状的植物组织样品，按1：10的比例（质量：体积）在检测样品中加人样品提取缓冲液（见B.10），研磨成匀浆后，离心上清液作为检测样品.
对于已分离纯化的细菌纯培养，用样品提取缓冲液（见B.10）制备约106CFU/mL的菌悬液作为检测样品.
对于潜伏侵染的植物组织样品，制成样品悬浮液后（见附录D），用样品悬浮液进行检测.
按试剂操作说明书或按SN/T1135.5一2007中5.2给出的试验方法.用Cms已知菌株作阳性对照，并设置相应的阴性对照.
6.6分子生物学检测
6.6.1PCR检测
本标准提供多个检测Cms的PCR方法，任意选用其中一种PCR法进行检测，按F.1和F.2给出的方法.用Cms已知菌株作阳性对照，并设置相应的阴性对照和空自对照.
6.6.2实时荧光PCR检测
本标准提供2个检测Cms的实时荧光PCR方法，任意选用其中一种方法进行检测，按F.1和F.3给出的方法.用Cms已知菌株作阳性对照，并设置相应的阴性对照和空白对照.
6.7致病性测定
按附录G给出的方法，把培养3d的纯培养物制备成约10CFU/mL菌悬液，接种到5~10株茄子幼苗的茎杆上.用新鲜配制的马铃薯环腐病菌已知菌株制备成约0°CFU/mL~10CFU/mL的菌悬液作为阳性对照，接种5株茄子幼苗.用无菌水作为阴性对照，接种5株茄子幼苗.
7结果判定与报告
7.1结果判定
7.1.1当BIOLOG检测或DAS-EILS检测或分子生物学检测（PCR方法或实时荧光PCR方法），其中7.1.2当DAS-EILSA检测或分子生物学检测（PCR方法或实时荧光PCR方法）初筛检测结果为阴 两种基于不同原理的方法检测结果为阳性、且致病性测定为阳性时，判定为马铃薯环腐病菌.性，或只有其中一种检测方法结果为阳性时，判定为非马铃薯环腐病菌.
7.2结果记录与保存
7.2.1记录各项实验数据，包括样品种类、来源，检测时间、地点、方法和结果等.DAS-ELISA检测结 果保存吸光值的数据报告，PCR检测结果保存电泳照片，实时荧光PCR检测结果保存采集的数据.7.2.2检出马铃薯环腐病菌的马铃薯块茎、茎秆、或叶片等样品，在超低温冰箱中保存，以备复核；分离纯化的马铃薯环腐病菌保存到超低湿冰箱中，或冻干后低温保存.
