T/NXSLX 宁夏饲料工业协会团体标准
T/NXSLX0103-2025
山羊支原体山羊肺炎亚种（Mccp）实时荧光 定量PCR检测技术规程
Regulation of practice for detection of Mycoplasma capricolum subsp.Capripneumoniae by quantitative real-time PCR
宁夏饲料工业协会 发布
前言
起草. 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定
本文件某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由宁夏饲料工业协会归口.
本文件起草单位：宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心、青岛立见生物科技有限公司.
本文件主要起草人：吴亚文、邸静、安玲玲、尹才、白涛涛、罗龙龙、任子昱、蔡冬冬、吴绿怡、周爽、王晓亮、李知新、周海宁、王建东、郭亚男、张成莲、马龙、马彦龙、赵燕、马金昕.
山羊支原体山羊肺炎亚种（Mccp）实时荧光定量PCR检测技术规程
1范围
本文件规定了山羊支原体山羊肺炎亚种（Mccp）实时荧光定量PCR检测时的仪器设备、样品采集、保存和运输、实时荧光定量PCR操作程序、结果判定、注意事项.
本文件适用于山羊的鼻拭子、肺脏和胸水等样品中Mccp核酸的检测.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本 文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T34720山羊接触传染性胸膜肺炎诊断技术NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3. 1
山羊支原体山羊肺炎亚种Mycoplasma capricolum subsp.Capripneumoniae，Mccp
山羊支原体山羊肺炎亚种是引起山羊传染性胸膜肺炎（CCPP）的病原体，属于支原体科支原体属，无细胞壁、能通过细菌滤器的革兰氏阴性微生物.
4仪器设备
4.2Ⅱ级生物安全柜. 4.1荧光聚合酶链式反应检测仪（PCR仪）.4.3台式冷冻离心机（可控温至4C、离心速度可达13000r/min以上）.4.4冰箱（2℃~8℃、-20C和-70℃）. 4.5微量移液器（0.1μL~2.5μL、1μL~10μL、10μL~100μL、100μL~1000μL）及匹配的带滤芯吸头.4.7.11.5ml和5mL离心管.4.7.20.2mLPCR薄壁管或八联管. 4.7.35mL样品保存管.
4.6高压灭菌锅.
4.7耗材.
5试剂
5.1除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的三级水.5.2DNA提取试剂盒. 5.3Mccp引物荧光探针引物和序列（参见附录A）.5.4荧光PCR酶.反应液含有Taq聚合酶和反应缓冲液配制（参见附录B）.5.5阳性对照.灭活的Mccp-14020培养物，经GB/T34720规定的PCR方法和细菌基因组三代测序验 证为Mccp 病原.
5.6阴性对照.用无菌无核酶水作为阴性对照.
6样品的采集、保存和运输
6.1样品的采集
样品的采集按照NY/T541的规定执行.取发病山羊的鼻拭子、肺脏和胸水等样品.
6.2样品的保存
采集的样品无法在12h内送检的情况下，应根据不同的检测要求，将样品按所需温度分类保存于冰箱、冰柜中.
6.3样品的运输
2℃～8C的容器中冷藏运输：对于不能在24h内送达实验室但不影响检验结果的样品，应以冷冻状态 采集的样品应以最快最直接的途径送往实验室，对于可在采集后24h内送达实验室的样品，可放在运送.
6.4样品的处理
在样本制备区进行.样品处理方法按照GB/T34720规定执行，处理过程中的生物安全要求和措施，按照GB19489进行，涉及到的基因扩增和分区要求的按照GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要 求规定执行.
肺脏组织样品处理方法，取50mg，放入盛有500uL灭菌水的无菌无酶研磨管中，6000r/min振荡研磨45s，3000r/min离心10min，取上清液经13000r/min离心20min：弃上清收集沉淀，提 取核酸.
液体样品胸水用灭菌水1:1稀释后，3000r/min离心10min，取上清液经13000r/min离心20min后，弃上清收集沉淀，提取核酸.
拭子样品处理方法鼻拭子制于1mL灭菌水中，充分捻动，挤干后弃去拭子，3000r/min离心10min，取上清液经13000r/min离心20min后，弃上清收集沉淀，提取核酸.
7荧光PCR操作程序
7.1样品DNA提取
扩增，如不能立即检测，4C保存不宜超过8h，长期保存应制-70C. 在核酸提取区进行.可用商品化的DNA提取试剂盒提取样品的DNA.提取的DNA应立即进行荧光PCR
7.2反应体系的配制
反应配制应在专门的区域进行.采用25口L反应体系，扩增体系配制如下：酶反应液 17. 5 μ1上游引物（10mo1/L) 下游引物（10μmo1/L) 1μL 1 μL0.5μL
探针（5μmol/L)样品DNA或对照 5 μL
7.3荧光PCR反应
在检测区进行.在荧光PCR仪上选用FAM通道，设置如下反应参数：
37C孵育2min:95C预变性20s：95C变性10s，60C退火延伸30s，共40个循环：设置60C收集FAM荧光信号.
8结果判定
8.1阅值设定
阔值设定原则根据不同的荧光PCR仪的噪声情况进行调整，以阅值线刚好超过正常阴性样品扩增的最高点为准.
8.2质量控制
FAM信号通道下，阳性对照应出现典型的扩增曲线且Ct值<30.0，阴性对照无典型的扩增曲线或无Ct值，则试验成立：否则试验不成立. 8.3结果描述及判定 8.3.2被检样品扩增结果无典型的扩增曲线或无Ct值时，判定为Mccp核酸阴性. 8.3.1被检样品有特异性扩增曲线，而且Ct值≤35.0，判定为Mccp核酸阳性（参见附录C）.8.3.3被检样品有特异性扩增曲线，当样品的扩增结果35.0<Ct值≤40.0时，可判定为Mccp核酸可疑：可疑样品进行1个反应复检，若样品复检有特异性扩增曲线，而且Ct值≤40.0时，判定为Mccp 核酸阳性：若样品复检结果无典型的扩增曲线或无Ct值时，判定为Mccp核酸阴性. 9注意事项 本方法样品处理过程中使用的耗材和器Ⅲ，应高压灭菌处理：在荧光PCR反应中使用过的枪头和PCR反应管，禁止高温高压处理，应用2%的84消毒液浸泡30min后，再作为医疗废弃物处理.
