I/NXSLX 宁夏饲料工业协会团体标准
T/NXSLX0403-2025
非洲猪瘟病毒（ASFVI型毒株、ASFVII 型毒株混合或ASFVI&II型嵌合毒株）实时 荧光定量PCR检测技术规程
《African Swine Fever Virus (ASFV Type I Strain ASFV Type II Strain Mixed orASFV I&II Chimeric Strain)Real-Time Fluorescent Quantitative PCR DetectionTechnical Specification》
宁夏饲料工业协会 发布
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
本文件某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心提出.
本文件由宁夏饲料工业协会归口.
本文件起草单位：宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心、青岛立见生物科技有限公司、惠农区动物疾病预防控制中心、贺兰县农业技术推广服务中心、同心县动物疾病预防控制中心.
本文件主要起草人：马龙、李莉、艾文、葛栋、李知新、张玉玲、尹才、罗龙龙、靳善来、吴绿怡、吴昊林、陈思思、装元礼、任子煜、路静、王晓亮、周海宁.
非洲猪瘟病毒（ASFVI型毒株、ASFVII型毒株混合或ASFVI&II 型嵌合毒株）实时荧光定量PCR检测技术规程
1范围
本文件规定了非洲猪癌病毒（ASFVI型毒株、ASFVII型毒株混合或ASFYI&II型嵌合毒株）实时荧光定量PCR检测时的实验室检测样品采集及处理、荧光定量PCR方法、结果判定、注意事项.
本文件适用于猪全血、血清、口鼻拭子、组织、环境拭子等样本中的检测.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本 文件.
GB/T18648-2020非洲猪瘟诊断技术 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3缩略语
下列缩略语适用于本文件.
ASF：非洲猪瘟（African Swine Fever）ASFV:非洲猪癌病毒（African Swine Fever Virus） PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Bolution）PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）
4生物安全措施
进行ASFV实时荧光定量PCR检测时，如样品处理、核酸提取等，应按照GB/T19489执行.
5实验室检测样品采集及处理
5.1试剂
5. 1.10.1mo1/LPBS（pH7.4).配制方法见附录A的A.1.5.1.20.4mo1/LPBS（pH7.4).配制方法见A.2.5.1.350%甘油-PBS保存液.配制方法见A.3.
5.2采样用具
5.2.1器械：剪刀、镊子、组织匀浆器等.5.2.2容器：真空采血管（含EDTA抗凝剂）、离心管（2ml、5ml、10ml）、样品保存管等.5.2.3个人防护用具：防护服、防护帽、防护靴、口罩、一次性手套等. 5.2.4采样记录用品：采样单、记号笔、防水标签等.5.2.5其他：医用棉签、医用纱布、封口膜、冰袋等.
5.3样品采集
5.3.1全血样品来集
后冷藏或冷冻保存. 在发病猪群中，使用真空采血管（含EDTA抗凝剂）采集一定数量发病猪、同群猪全血各5m1，密封
5.3.2血清样品采集
在每一发病猪中，采集发病猪、同群猪全血各5m1，室温放置12~24h，分离血清，装入离心管中，密封后冷藏或冷冻保存.
5.3.3口、鼻拭子采集
采集病死猪或发病猪、同群猪的口鼻拭子样品.用医用棉签在口腔或鼻腔转动至少3圈，采集口腔、鼻腔的分泌物：蘸取分泌物后，立即将拭子侵入1ml50%甘油-PBS保存液中，剪去露出部分，盖紧离心管盖，密封后冷藏冷冻保存.
5.3.4组织样品采集
采集病死猪或扑杀发病猪的组织样品.首选脾脏，其次为扁桃体、淋巴结、肾脏等.脾脏、肾脏采集约3cmX3cm大小，扁桃体整体采集，淋巴结选取出血严重的整体采集.将所采集样品放入50%甘油-PBS 保存液中.
5.3.5环境拭子来集
采集病死猪或发病猪、同群猪圈内地面周边环境拭子样品.用医用棉签在圈内四周和中间方向蘸取污染物，立即将所采集样品拭子侵入1ml50%甘油-PBS保存液中.
5.4样品处理
5.4.1全血样品处理
全血标记样品编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用.
5.4.2血清样品处理
血清标记样品编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用.
5.4.3口、鼻拭子处理
口、鼻拭子标记样品编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用.
5.4.4组织样品处理
取适量采集的组织样品置于组织匀浆器中充分研磨，灭菌的0.1mo1/LPBS（pH7.4）制备10%组织匀浆液.2000r/min离心处理10min.取上清液，标记编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用.
5.4.5环境拭子处理
环境拭子样品编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用.
6荧光定量PCR方法
6.1试剂
6.1.1DNA提取试剂盒. 6.1.2无核酸酶水，配制方法见附录B的B.1.6.1.3荧光PCR预混液（2×）.
6.2仪器设备
6.2.1荧光PCR扩增仪. 6.2.2高速冷冻离心机（最大离心力12000g以上）.6.2.3微量可调移液器（2.5L、10l、100uL、200pL、1000L等不同规格）.6.2.4无核酸酶离心管与吸头. 6.2.5PCR扩增管.
6.3引物探针
引物探针是根据已发布的毒株序列进行设计.上游引物ASFV IF：5'-CCCCTGAAATACACAACCTTTTG-3”：下游引物ASFV IR:5′CACCTGCGTTTTATGGACACGTA3':TaqManASFV IT:FAM-TTCGCTTCTCGCTGA-MGB.上5′ACCTGCGTTTTATGGACACGTA3'：TaqManASFV IIT:VICTTCGATTCTCCCTGAMGB.上引I物ASFV I&IIF: 游引物ASFVIIF：5'-TAACCCCTGAAATACACAACCTTTT3’：下游引物ASFVIIR：5′ GAAGAAGAACAATGTCAGCATGATG3” :下 游 引|物ASFV I&1IR: 5′ CGACTGTAAGGCTTAGGAAGTAATGG3' :TaqManASFV I&IIT:Cy5CACTTCCATACATGAACCATCTCCCAGAGABHQ2.
6.4试验程序
6.4.1核酸提取
酸.如在2h内检测可将提取的核酸置于冰上保存，否则应置于-20℃冰箱保存. 采用DNA提取试剂盒提取各类样本中的病毒核酸，或用自动化核酸提取仪提取各类样本中的病毒核
每次抽提核酸，应至少包括一个阳性对照和一个阴性对照.阳性对照样品应为ASFV核酸阳性样本（全血、血清、10%组织匀浆上清液）：阴性对照样品应为无核酸酶水.
6.4.2核酸扩增
6.4.2.1扩增体系
6.4.2.1.1每个样品配制20口L荧光PCR反应混合液，组成如下：
无核酸酶水 7.22 μ L荧光PCR预混液（2×） 12. 50 μ LASFV IF (10 μ mo1/L) ASFV IR (10 μmo1/L) 0. 10 μ L 0. 10 μ LASFV IT (10 μmo1/L) 0. 08 μ L
6.4.2.1.2每个样品配制20pL荧光PCR反应混合液，组成如下：
无核酸酶水 7. 20 μ L荧光PCR预混液（2×） 12. 50 μ LASFV IIF (10 μmo1/L) ASFV IIR (10 μmo1/L) 0. 10 μ L 0. 10 μ LASFV IIT (10 μmo1/L) 0.10 μL
6.4.2.1.3每个样品配制20uL荧光PCR反应混合液，组成如下：
7. 25 μ L无核酸酶水 荧光PCR预混液（2×） 12. 50 μ LASFV I&IIF (10 μ mo1/L) 0.10μL 0. 10 μ LASFV I&IIR (10μmo1/L) ASFV I&IIT (10 μmo1/L) 0. 05 μ 1
