T/ZJSC 2025-0024
中华鳖腮腺炎诊断方法
Diagnostic methods for mumps in Chinese soft-shelled turtle
浙江省水产学会 发布
前言
起草. 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定
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本文件由浙江省水产学会提出并归口.
本文件起草单位：浙江省淡水水产研究所、浙江省农业科学院.
中华鳖腮腺炎诊断方法
1范围
仪器设备，描述了临床症状、样品采集、解剖学及组织病理检查、病原菌分离及形态观察、细菌PCR检 本文件给出了中华鉴（Pelodiscus sinensisWiegmann，1834）腮腺炎诊断的缩略语、试剂和材料、测、病毒套式RT-PCR检测以及综合判定的方法.
本文件适用于中华鉴腮腺炎的流行病学调查、诊断、检疫和监测.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T28630.4白斑综合征（WSD）诊断规程第4部分：组织病理学诊断方法SC/T7011.1水生动物疾病术语与命名规则第1部分：水生动物疾病术语 SC/T7011.2水生动物疾病术语与命名规则第2部分：水生动物疾病命名规则
3术语和定义
SC/T7011.1和SC/T7011.2界定的术语和定义适用于本文件.
4缩略语
bp:碱基对（base pair） 下列缩略语适用于本文件.cDNA:互补DNA (plementary DNA)DEPC：焦碳酸二乙酯（diethy1pyrocarbonate） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）dNTPs：脱氧核苷三磷酸混合物（deoxy-ribonucleotide triphosphate mixture）0ligo（dT）：15个胸腺喀啶组成的寡聚核苷酸 EDTA:乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid)PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）RNA：核糖核酸（ribonucleic acid） RTPCR：逆转录PCR（reverse transcription PCR）Taq DNA聚合酶：水生栖热菌DNA聚合酶（thermus aquaticus DNA polymerase）TSA：胰酪大豆陈琼脂（tryptic（trypticase）soy agar） TSB：胰酪大豆陈肉汤（tryptic soy broth）TSHSV：中华整出血综合征病毒（Trionyx sinensis hemorrhagic syndrome virus）
5试剂和材料
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水.
5.1琼脂糖：电泳级，常温保存.
5.2电泳核酸染料：溴化乙锭或其他等效试剂，-20C保存.5.3DNA分子质量标准溶液：Marker DL2000，-20C保存.5.4MgC1（25mmol/L）：-20C保存.5.5dNTPs（10 mmol/L）：含 dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 2.5mmol/L的混合物，-20“C保存.5.6TaqDNA聚合酶（5U/uL）：-20C保存.5.710×PCR缓冲液（无Mg）：随TaqDNA聚合酶提供，-20C保存.5.86×载样缓冲液：室温保存.5.95XM-MLV逆转录酶缓冲液：商品化试剂，-20C保存.5.10M-MLV逆转录酶（200U/uL）：商品化试剂，-20“C保存.5.11RNA酶抑制剂（40U/uL）：商品化试剂，-20C保存.5.12TRIzoL试剂：商品化试剂，4‘C保存.5.13氯仿：分析纯，常温保存.5.14无水乙醇：分析纯，常温保存.5.15异丙醇：分析纯，常温保存.5.1601igo（dt）（50μmol/L）：商品化试剂，-20C保存.5.17TSA培养基：按A.1配制.5.18TSB培养基：按A.2配制.5.1975%乙醇：按A.3配制.5. 20 EDTA（0.5 mo1/L，pH 8.0)：按A. 4配制.5.211XTAE电泳缓冲液：按A.5配制.5. 22号|4物 HPBcF：5′CTACAGGTCGCAGATAAAACAGTC3’;引物 HPBcR:5′GCAAGGGCTAAAAATGAAATCT3′：引物 TSHSV-hp2-F1:5’-ACCAGGATCATGGCCCACCTAC3′:引物 TSHSVhp2-R1:5’TTCTTGGCAACATCGGCTTTCT3′：引物 TSHSV-hp2-F2:5’GGGGACTGCTGGAACTCTATTA3’;引物 TSHSV-hp2R2: 5’ GTTTGGACCAGAAAGGTGAATG3’5.23阳性对照：受蜡样芽孢杆菌感染的鉴组织样品，用于细菌PCR检测：受中华整出血综合征病毒（TSHSV）感染的整组织样品，用于病毒套式RT-PCR检测.5.24阴性对照：未受蜡样芽孢杆菌感染的整组织样品、未受TSHSV感染的整组织样品.5.25空白对照：无菌双蒸水.6仪器设备6.1恒温培养箱.6.2切片机.
6.3组织脱水机.
6.4包理机.6.5染色机.6.6展片水浴锅.6.7平板烘片机.6.8封片机.6.9水平电泳仪.6.10普通PCR仪.6.11摇床.6.12紫外观察仪或凝胶成像仪：波长范围280nm～320nm.6.13光学显微镜.6.14高速冷冻离心机：转速12000rpm以上.6.15微量移液器.6.16生物安全柜.
7临床症状
水面游动时左右摇摆，形似“摇头”，严重时病整口鼻出血，部分病鉴底板发红，见B.1. 发病前期病整表现出行动迟缓，食性下降发病后期可见病整多卧在岸边，脖子肿胀，软弱无力，在
8样品采集
8.1采样对象
稚鳖、幼鉴、成整等.
8.2采样部位
无菌采集脾脏、肝脏、肾脏、肺和肠道组织样品.
8.3采样数量
具有临床症状的幼鉴或成整采3只～5只：稚整、无临床症状的幼整或成整采8只～10只.
8.4保存和运输
鲜24h内送达实验室.采样应加贴标签，标签上清楚标明样品编号、采样时间、采样地点. 做组织病理检查的鉴样应活体送达实验室，及时取样检测：不做组织病理检查的鉴样，应活体或冰
9解剖学及组织病理检查
9.1样品处理和观察
将纱布浸75%乙醇后，覆盖于病整表面，或用含75%乙醇的棉球擦拭.针对幼整和成整，无菌解剖整GB/T28630.4的方法进行组织固定、脱水、石蜡包埋、切片、苏木精染色和伊红染色、封片，并置于光 背甲，观察鉴口咽腔及内脏：取肝脏、脾脏、肾脏和肠道组织，迅速切成厚度不超过3mm的组织块，按学显微镜下观察.鉴腮腺炎解剖学特征示例见B.2和B.3，组织病理特征示例见B.4.
9.2结果判定
