中华人民共和国国家标准
GB/T29375-2012
马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程
Code of practice for in-vitro virus free seed potatoes plantlets breeding
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由中华人民共和国农业部提出.
本标准由全国蔬菜标准化技术委员会（SAC/TC467）归口.
本标准起草单位：内蒙古大学内蒙古马铃薯工程技术研究中心、中国标准化研究院、甘肃爱兰马铃薯种业有限责任公司、定西马铃薯研究所，重庆市薯类脱毒种苗快繁中心、秘鲁国际马铃薯中心北京联络处、四川省凉山州良圆马铃薯种业有限责任公司、内蒙古希森马铃薯种业有限公司、成都科欣农业生 物工程有限责任公司、北京辛普劳食品加工有限公司、湖南农业大学园艺学院、东北农业大学农学院、华南农业大学园艺学院、云南省宣威市马铃薯种薯研发中心、福建省农业科学院作物研究所、河北省郑州市蔬菜研究所、云南省丽江市农业科学研究所、中国农业科学院农业资源与农业区划研究所、内蒙古铃田生物技术有限公司.
黄振霖、谢开云、严欣、王官茂、陈涛、曲仁山、熊兴罐、王风义、曹先维、展康、汤浩、吴焕章、王绍林、罗其友、 本标准主要起草人：张若芳、杨丽、周爱兰、孙清华、吴蕾、杜密茹、巩秀峰、王义、宋荣庆、李进福、李文刚.
马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程
1范围
本标准规定了马铃薯茎尖脱毒与组织培养、脱毒试管苗扩繁的技术要求和操作规程.本标准适用于马铃薯脱毒试管苗的培育、扩繁.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB18133-2000马铃薯脱毒种薯
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3. 1 叶原基leafprimordium在茎尖生长点的基部形成的突起.
3.2
茎尖stem tip
芽顶端部分（0.1mm~10mm）其中包括分生组织（0.05mm~0.1mm）及芽原基和正在发育的叶原基.
茎尖分生组织meristem
茎部位具有持续或周期性分裂能力的细胞群.
3.4
离体培养in-vitro propagation
从植物体分离出符合需要的器官、组织、细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术，
3.5
脱毒苗in-vitro virus free plantlet
经检测确认不带马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯卷叶病管苗. （S（）（）（）
9
核心苗core plantlet
通过茎尖分生组织培养技术获得的经检测无病毒，经试种观察具有原品种典型性状的脱毒苗.
基础苗basic plantlet
由核心苗繁殖的、经检测无病毒的脱毒苗.
4试管苗生产车间
4.1布局原则
生产隔离.要具备更衣室、清洗室、配制室、灭菌室、无菌贮存室、接种室、培养室等，各房间应隔离.生 脱毒苗生产车间布局应遵循方便消毒、减少污染的原则，遵守操作流程.周围应无污染源，与大田产环境应清洁、干燥，具有可提供充足自然和人工光源的组培室、车间或生产线.
4.2布局平面示意图
图1试管苗生产车间布局平面示意图
4.3设备、试剂
试管苗生产的组培设备、试剂参见附录A.
4.4卫生要求
4.4.1接种室、培养室应保持卫生，定期消毒，每周至少消毒一次.按照40%的甲醛和高锰酸钾2：1
的比例，40%的甲醛溶液10mL倒人5g高锰酸钾容器内（每立方米空间用量），进行熏蒸.密闭1d后，通风.4.4.2接种前接种室应强制过滤通风.4.4.3每次使用超净工作台前，应提前20min打开紫外灯.接种时关闭紫外灯打开风机，超净工作台 面及内壁用75%乙醇擦拭消毒.4.4.4操作使用的工具，使用前应灭菌.操作过程中镊子、剪刀、解剖刀等工具，每次使用前接触植物材料的部分应灼烧消毒或插入高温灭菌器中灭菌，冷却后使用，避免交叉污染.清擦，4.4.6若将温室作为培养室，在温室配备有降温水帘和风机，水帘外进风方向应加孔径0.247mm （60目）网纱.温室内门口有缓冲间，在缓冲间应有消毒装置，可放人生石灰或其他消毒剂，工作人员进人时鞋底消毒.
4.4.7发现污染及时清除.
5茎尖脱毒与培养
5.1脱毒材科的选取
5.1.1田间选择
5.1.1.1在土壤肥力中等的地块，于现蕾期至开花期选择生长势强、具备原品种典型性状的键康植株，做好标记.品种典型性状植株的中、下部短枝茎尖或腋芽进行茎尖剥离.
5.1.1.2生育后期到收获期在已做标记的植株中进行薯块复选.选择无病班、虫蛙、机械损伤面且皮色、肉色、薯形、芽眼等性状符合品种特征的幼龄薯，清洗泥土后催芽作为脱毒材料：或选取健康且具备
5.1.2病毒检测筛选
人选的块茎或植株，按照GB18133-2000中附录B的方法检测类病毒（PSTVd)：按照GB181332000中附录A的方法检测病毒.筛选无类病毒（PSTVd）的块茎或植株作为茎尖脱毒基础材料：若检测到没有带病毒的块茎或植株，可直接剥较大的茎尖.其后可不经试种观察直接进行扩繁培养.
5.1.3催芽处理和病毒钝化
5.1.3.1块茎可通过自然方法出芽或通过人工方法（用1%硫脲十5mg/L赤霉素的溶液浸种5min）打破休眠催芽.
5.1.3.2自然出芽的情况下，块茎长出2cm~3cm的新芽.对含有S病毒、X病毒的块茎需置于 37C土1C培养箱中处理3周～4周，钝化病毒.
5.1.3.3人工打破休眠催芽的情况下，可采用0.1%多菌灵溶液浸泡30min或75%乙醇喷湿进行表面消毒，置于25C黑暗条件下催芽：或播种于含水量20%灭菌细沙中发芽（水中含5mg/L多菌灵），块4周，钝化病毒. 茎长出2cm~3cm的新芽.对含有S病毒、X病毒的块茎需置于37℃士1C培养箱中处理3周~
5.2茎尖培养
5.2.1茎尖培养基的制备
5.2.1.1茎尖培养基配方参见附录B.5.2.1.2将制备好的蒸尖培养基快速分装于容器中，用封口膜封口，菌贮存室放置3d~5d，无污染的培养基放到超净工作台备用.
5.2.2材料消毒
后，移入接种室进行严格消毒.先用75%乙醇浸泡30s，再用50g/L的涨白粉液浸泡7min~10min 取经催芽处理和病毒钝化处理的块茎的顶芽、2cm～3cm的侧芽，剪去外叶，用自来水冲洗30min或0.1%的氯化汞溶液浸泡5min~10min，然后用无菌水冲洗4次~5次.
5.2.3茎尖剥离与接种
接种在超净工作台上操作.剥去外叶，借助40×双目解剖镜，剥离茎尖直至露出半圆形光滑生长点，用解剖刀或解剖针从0.1mm~0.3mm处切，带1个~2个叶原基.迅速接种于盛有茎尖培养基的容器中，进行离体培养.用酒精灯烤干容器口并封口，在容器上注明编号、品种名称、接种时间.
