中华人民共和国国家标准
GB/T29581-2013
胡椒叶斑病菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Xanthomonas axonopodis pv.betlicola(Patel et al.)Vauterin et al.
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准起草单位：中华人民共和国海南出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：刘福秀、冯黎霞、龙海、李伟东、凌杏园、韩玉春、周先超.
胡椒叶斑病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了胡椒叶斑病菌（Xanhomonasaxonopodispv.berficola）的检疫和鉴定方法.本标准适用于植物苗木等繁殖材料及组织中胡椒叶斑病菌的检疫和鉴定.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T4789.28-2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂
3胡椒叶斑病菌基本信息
中文名：胡椒叶斑病菌（胡椒细菌性叶斑病菌：地毯草黄单胞杆菌萎叶致病变种）.
学名 :Xanthonionas a.zono podis pv berlicola (Patel， Kulkarni &. Dhande 1951) Vauterin. HosteKersters &. Swings 1995.
异名:Xaxthomonas cam pestris pv.betlicola (Patel Kulkarni &. Dhande 1951) Dye 1978.
病害英文名：bacterial leaf spot of pepperpepper bacterisl lenaf spot.
属原核生物界Procaryotes、变形细菌门Proteobaeteria、y-变形细菌纲Gammaproteobacteria、黄单胞菌目Xanthomonadales、黄单胞菌科Xanthomonadaceae、黄单胞菌属Xaazhomonas、地毯草黄单胞杆菌 Xanthomonas azonopodis.
胡椒叶斑病菌的其他信息参见附录A.
4方法原理
根据胡椒叶斑病菌的寄主范围、培养性状、生理生化特性和所致病害的症状特点，采用病原菌的分离、病菌培养性状观察、生理生化特性检测以及致病性测定等方法进行检测和鉴定.
5试剂与培养基
5.1试剂
无菌水、琼脂、酵母提取物、蛋白陈、葡萄糖、营养琼脂、牛肉膏、氯化钠、氢氢化钠.
果糖、木糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、海藻糖、甘油、水杨苷、蔗糖、山梨糖、鼠李糖、棉子糖、肌醇、草酸钠、3-羟基丁酸钠、琥珀酸钠、苹果酸、乳酸钠、柠檬酸钠、酒石酸钠、DL-精氨酸明胶、石蕊牛奶.
5.2培养基
病菌分离采用NGA培养基（见附录B），病菌增殖采用营养琼脂培养基（见附录B）.
6仪器和用具
天平、搅拌器、冰箱（4C土2℃C：一80℃）、无菌（新）塑料封口袋、脱脂棉、石棉铁丝网、高压灭菌锅、培养箱（29℃士1℃：或其他可以控制温度的暗室）、无菌昆虫针、紫外灯、小型离心机、酸度计（或精密pH试纸）、超净工作台等.
7检测与鉴定
7.1现场检疫
7.1.1感官检查
仔细检查，观察典型症状或可疑症状（参见附录A）.感病组织表面可能有菌脓.
7.1.2样品抽取
发现可疑植株，切取受害部位或将整棵植株取回实验室检验.
7.2室内检测与鉴定
7.2.1病原菌分离
取小块病组织用无菌水冲洗后放人0.5ml~2.0mL无菌水中，观察是否有细菌溢出.如果有喷菌现象，则用接种环挑取喷出的菌液，在NGA培养基（参见附录B）上划线分离.如没有喷菌现象，则用灭菌玻棒将病组织研碎，在室温下浸泡15min~20min，用接种环挑取组织液在NGA培养基上划线分离，看不到症状的情况下，用无菌水洗涤病组织（病组织为叶片时，洗涤量应在10片以上），洗涤液离 心浓缩后做适当稀释，在NGA培养基上划线分离.划线细菌在28C~30C下黑暗培养.至少设2个重复.3d后即可观察所产生的菌落.如果发现可疑的菌落应该及时使用NGA培养基进一步纯化培养观察，并进行后续试验.
7.2.2菌落形态观察
配制表1所列9种培养基，并按表1所列培养条件培养待检菌株，其中1是必需的，2~9可选.
表1胡椒叶斑病菌在不同培养基上的培养性状
序号 培养基 培养条件 典型培养性状1 营养琼脂 28℃~30℃下操荡培 28℃~30℃下培养7 d 菌落圆形黄色有光泽全缘稍隆起粘稠2 牛肉膏陈培养液 养24h或静止培养7d 培养液轻度浑浊，无液面生长，沉淀物不明显菌落圆形，直径1mm~2mm，表面光滑，闪光.边缘3 牛肉膏陈琼脂平面 28℃~30℃下培养 7 d 完整，乳陷状，低度凸起，半透明或不透明，乳白带浅 黄色28℃~30下振医培4 酵母膏陈培养液 养24h或静止培养7d 培养液轻度浑浊，无液面生长沉淀物不明显5 牛肉膏陈酵母葡萄 28℃~30℃下振落培 培养液中度浑浊液面生长环状沉淀物少量糖培养液 养24h或静止培养7d
表1（续）
序号 培养基 培养条件 典型培养性状6 糖琼脂斜面 牛肉膏陈酵母葡萄 28℃~30℃下培养7d 黄色，培养基不变色 菌苔均为线状、快速生长，乳略状，不粘稠，乳白带浅菌落圆形，直径3mm~5mm，表面光滑，闪光，边缘7 糖琼脂平板 牛肉膏陈酵母葡萄 28℃~30℃下培养 7 d 完整乳陷状低度凸起半透明或不透明乳白带浅黄色8 牛肉膏陈琼脂斜面 28℃~30℃下培养7d 黄色，培养基不变色 菌苔均为线状，中度生长，乳酪状，不粘朝，乳白带浅菌答均为线状，中度生长，乳酪状，不粘稠，乳白带浅6 酵母膏陈琼脂斜面 28 ℃~30 ℃ 下培养 7 d 黄色培养基不变色
结果判为阴性. 发现典型菌落的结果判为阳性，同时记录可疑菌落数，并进行后续试验.如没有发现典型的菌落，
7.2.3革兰氏染色
革兰氏染色按GB/T4789.28-2003中2.2的规定进行试验.观察革兰氏染色反应的试验结果和菌体形态.
胡椒叶斑病菌革兰氏染色呈阴性反应.典型菌体短杆状，末端圆形，大小为（0.4pm~0.7pm）×（1.0μm~2.4μm），单个或成双排列，有3~5个的短链.无芽愈，无英膜，有运动性，鞭毛为单根极生.
革兰氏染色呈阴性反应，且观察到菌体典型形态的结果判为阳性，并进行后续试验.如革兰氏染色反应呈阳性，或革兰氏染色反应呈阴性但没有观察到菌体典型形态，结果判为阴性.
7.2.4生理生化特性测定
将上述分离的等检细菌用微量生化反应管进行生理生化特性测定.以X.a.ronopodis pv.betlicola阳性菌株做对照，每个测定项目设3个重复.生理生化特性测定结果与附录C结果一致判定为阳性，并进行致病性测定.否则判为阴性.
7.3致病性测定
7.3.1针刺接种
采用平板划线法在营养琼脂培养基平板上纯化刚分离的待测细菌，在28℃～30℃温度下培养2d~4d，移出单个菌落后进一步扩大繁殖.取待测细菌在营养琼脂培养基上培养24h~48h，用灭菌的昆虫针蘸取菌落，在胡椒苗嫩叶背面进行刺伤接种（Pan-niyur系列品种或其他品种都行，国内主栽品种都感病）.每个菌株接种3片叶.接种标准的阳性菌株作为阳性对照，同时接种非致病菌和无菌水作 为阴性对照，接种后的植株置放于人工气候箱，在28℃～30℃温度下，先在100%相对湿度下保湿8h.接种5d~7d后，观察是否出现水渍状角形病斑，每天观察一次，接种后30d不表现症状的视为不发病.试验重复3次.
