中华人民共和国国家标准
GB/T 31270.16-2014
化学农药环境安全评价试验准则 第16部分：土壤微生物毒性试验
Test guidelines on environmental safety assessment for chemical pesticidesPart 16:Soil microorganism toxicity test
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
GB/T31270《化学农药环境安全评价试验准则》分为21个部分：
第2部分：水解试验： 一第1部分：土壤降解试验；第3部分：光解试验：第4部分：土壤吸附/解吸试验；第5部分：土壤淋溶试验； 第6部分：挥发性试验：第7部分：生物富集试验：第8部分：水-沉积物系统降解试验；-第9部分：乌类急性毒性试验；第11部分：家蚕急性毒性试验； 第10部分：蜜蜂急性毒性试验；-第12部分：鱼类急性毒性试验；第13部分：涵类急性活动抑制试验；第14部分：藻类生长抑制试验；一第16部分：土壤微生物毒性试验； 第15部分：蚯蚂急性毒性试验；第17部分：天敌赤眼蜂急性毒性试验：一第18部分：天敌两栖类急性毒性试验；-一第19部分：非靶标植物影响试验； 第20部分：家畜短期饲喂毒性试验；第21部分：大型甲壳类生物毒性试验.本部分是GB/T31270的第16部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任. 本部分由中华人民共和国农业部提出并归口.本部分负责起草单位：农业部农药检定所、环保部南京环境科学研究所.本部分主要起草人：程燕、范继巧、王娜、韩志华、赵玉艳、王彦华、李少男、蔡道基.
第16部分：土壤微生物毒性试验 化学农药环境安全评价试验准则
1范围
GB/T31270的本部分规定了CO吸收法和氮转化法测定化学农药对土壤微生物毒性的材料、条件、操作、质量控制、数据处理、试验报告等的基本要求.
本部分适用于为化学农药登记而进行的土壤微生物毒性试验，其他类型的农药可参照使用.
本部分不适用于易挥发和难溶解的化学农药.
2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
2.1
化学农药chemical pesticide
利用化学物质人工合成的农药.其中有些以天然产品中的活性物质为母体，进行仿制、结构改造，创新面成，为仿生合成农药.
同义词：有机合成农药synthetic organic pesticide.
[NY/T 1667.1-2008 定义 2.2.1]
2.2
原药technicalmaterial
在制造过程中得到的有效成分及杂质组成的最终产品，不能含有可见的外来物质和任何添加物，必要时可加人少量的稳定剂.
[NY/T1667.2-2008，定义2.5.1]
2.3
由农药原药（或母药）和助剂组成、使用状态稳定的产品.[NY/T1667.2-2008，定义2.4]
2.4
有效成分active ingredient；a.i农药产品中具有生物活性的特定化学结构成分.
[NY/T 1667.2-2008，定义 2.1]
2.5供试物test substance试验中需要测试的物质.
2.6
影咱率effect ratio
供试物对土壤微生物呼吸强度的影响程度，包括抑制率和促进率.供试物处理土壤呼吸强度低于对照土壤时，表现为抑制，供试物处理土壤呼吸强度高于对照土壤时，表现为促进.
GB/T 31270.162014
2.7
氮转化nitrogen transformation
微生物通过氨化和硝化作用，将含氮有机物最终降解为无机终产物硝酸盐的过程.
3试验概述
3.1方法概述
土壤微生物毒性试验包括CO吸收法和氮转化法，根据农药登记管理法规及其他规定选择相关方法进行试验.
3.2CO吸收法
在标本瓶内放置两只小烧杯，其中一只盛放土壤，另一只盛放碱液（如NaOH溶液），用于吸收土壤微生物呼吸所释放的C0：.以模拟农药常用量、10倍常用量、100倍常用量时土壤表层10cm土壤中量为最大田间持水量的40%～60%，于试验开始后的第1天、第2天、第4天、第7天、第11天、第15天 更换出密闭瓶中的碱液测定吸收的CO量.评价供试物对土壤微生物活性的影响.
3.3氮转化法
过筛的土壤与适量有机底物混合后用供试物处理，同时设置一组不加供试物的对照.试验至少需设置2个测试浓度，可参考供试物田间最大施用量设置.将土壤置于黑暗、20C士2C的条件下培养， 并保持土壤含水量为最大田间持水量的40%~60%，在培养0d、7d、14d和28d后，从处理组和对照组中取出一定量的土壤样品，用合适的溶剂浸提并测定提取液中硝酸盐的含量.比较处理组与对照组的硝酸盐形成率，计算处理组相对于对照组的百分比差异.试验至少持续28d.如果第28天处理组与对照组的差异不小于25%，则试验需延长，最长至100d.
4试验方法
4.1材料和条件
4.1.1供试物
农药制剂、原药或纯品.
4.1.2试验土壤
4.1.2.1CO吸收法
等）然后过0.85mm筛. 选用3种具有代表性的、理化性质各异的土壤，试验前先去除土壤中的租大物块（如石块、植物残体
4.1.2.2氮转化法
粗大物块（如石块、植物残体等），然后过筛，使土壤颗粒不大于2mm. 试验只需一种土壤，对土壤的要求参见附录A，土壤在用于试验前要先进行处理，先去除土壤中的
两种方法采用的土壤最好都为新鲜土壤，如果需要在实验室储存，则应置于4C士2℃黑暗处保存，最长保存3个月（土壤的采集、贮存方法参见附录B）.经过储存的土壤，在试验前需进行预培养
2d~28d，预培养期间土壤的培养条件应与试验条件一致.此外，氮转化法所用的土壤在试验前还需补充适当的有机底物，例如，首-青草-青贮谷粉（主要组成部分：紫花首稽Medicagosarir），C/N比在12/1~16/1之间.建议首稽粉与土壤的比率为每千克土壤（干重）用首稽粉5g
4.1.3主要仪器设备
主要仪器设备如下：
-搅拌器；培养箱： 振荡器；离心机；滴定仪：硝酸盐测定仪；“一标本瓶及其他玻璃器Ⅲ等.
4.1.4试验条件
4.1.4.1CO吸收法
土壤样品的培养条件为25℃士1℃，黑暗.试验过程中，保持土壤样品含水量在田间最大持水量的40%～60%之间，变化范围为士5%，如有需要，可添加蒸馏水和去离子水进行调节.
4.1.4.2氨转化法
土壤样品的培养条件为20℃士2℃，黑暗.试验过程中，保持土壤样品含水量在田间最大持水量的40%～60%之间，变化范围为土5%，如有需要，可添加燕馏水和去离子水进行调节.
4.2试验操作
4.2.1CO吸收法
4.2.1.1处理与对照的设置
每种土壤设3种不同浓度处理，以模拟农药常用量（推荐的最大用量）、10倍量、100倍量时土壤表层10cm土壤中的农药含量（计算时假设土壤容重为1.5gcm²），同时设置一组空白对照，每组至少设置3个重复.
4.2.1.2受试物质的制备
水溶性供试物一般用水溶解制备，避免使用水以外的其他液体，如丙酮、三氯甲烷等有机溶剂，以防止破坏微生物菌群.对于难溶物质，可先用合适的溶剂溶解或悬浮，然后包埋石英砂（粒径：0.1mm～0.5mm）等情性固体，最后等溶剂完全挥发后再将石英砂与土壤混合，为使供试物在土壤中达到一个 最佳的分布状态，建议每千克干重土壤中加人砂的比例为10g/kg.对照组的土壤样品用等量的水或砂进行处理.混合时，应确保处理组中的供试物在土壤样品中均匀分布，同时要避免土壤压紧或结块.
4.2.1.3土壤样品的培养
将混合后的土壤装于小烧杯中，与另一个装有标准碱液的小烧杯一起置于密闭瓶中，于25℃土1℃、黑暗条件下培养.试验过程中，保持土壤样品含水量在田间最大持水量的40%～60%之间，变化范围为士5%，如有需要，可添加蒸馏水和去离子水进行调节.
