中华人民共和国国家标准
GB/T31789-2015
冬生疫霉菌检疫鉴定方法
Detection andidentification ofPhytophthora hibernalis Carne
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任. 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口，本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局.本标准主要起草人：杜洪忠、吴品珊、王宏毅、严进、张秋.
冬生疫霉菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了冬生疫霉菌的检疫鉴定方法.
本标准适用于针对冬生疫霉菌寄主的苗木、枝条、枝叶、果实以及夹带土壤和介质中冬生疫霉菌的鉴定.
2位器和用具
2.1仪器
生物显微镜、超净工作台、光照培养箱、电子天平（1/1000g）、高压灭菌锅、冰箱、PCR扩增仪、荧光PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅.
2.2用具
烧杯、三角瓶、量筒、试管、培养Ⅲ、酒精灯、摄子、剪刀、解剖刀、接种针、载玻片、盖玻片、塑料研、移液器、移液器吸头、离心管、液氮罐.
3试剂、材料和培养基
3.1试剂
匹马霉素（pimaricin），氨苄青霉素钠盐（ampicillin），利福平钠盐（rifampicin），五氯硝基苯（penta-chloronitrobenzene），碳酸钙（CaCO），β-谷留醇（β-sitosterol），色氨酸（1ryptophan），硫氨（thiamine），氯化钙（CaCl:HO），次氯酸钠（NaC1O）.
（十六烷基三甲基澳化铵），TAE，无水乙醇（Ethanol），三氯甲烷（Chloroform），异丙醇（Isopropanol），异 琼脂糖，Tris-HCI.MgCI ，HC1 EDTA（乙二胺四乙酸四钠盐），NaOH，NaOAc，KC1 Tris CTAB戊醇（Isoamylalcohol)，SYBR Green I核酸染料，蛋白酶K，Tag DNA聚合酶，dNTPs DNA 相对分子质量标准物，PCR引物 PHIB1和 PHIB2，实时荧光 PCR引物 PH-F 和PH-R及TagMan-MGB 探针PH-Pr.
3.2材料
琼脂粉、V8汁、雪松松针（Cedras deodara）、相橘叶片（Citrus spp-）、胡萝卜、玉米油.
3.3培养基
V8培养基、胡萝卜丝培养基CPA、选择性培养基PARP-V8和卵孢子培养基，具体配方参见附录B.
4检疫签定方法
4.1症状检查
重点观察柑橘果实是否有褐色病变，叶和小枝是否枯菱；杜鹏属植物，观察叶片是否有深褐色病斑，
GB/T 31789-2015
或整个叶片和叶柄变褐：参见附录A.玫瑰受害症状为叶部和小枝枯菱，茎基部有深紫色到黑色病斑；其他寄主上为根部腐烂或溃疡.
4.2分离培养和诱集
4.2.1寄主组织分离培养
可疑症状的根、茎、叶、果实用流水冲洗表面约15min，在病健交界处或变色部位切取边长为5mm×5mm的样品，灭菌滤纸吸干水分，放于选择性培养基PARP-V8上，或用0.5%次氯酸钠消毒2min~5min，无菌水冲洗3次，灭菌滤纸吸干水分，放于胡萝下丝培养基或稀释5倍或10倍的V8培养基上.
黑暗培养.
4.2.2土壤和介质诱集
鲜膜封口，置于16℃~20℃黑暗放置. 称取25g土壤或介质，碾碎、去杂放人灭菌烧杯中，加人无菌水将土壤或介质润湿（无游离水），保
3d～5d后在烧杯中加人灭菌水，使水层高4.0cm，取雪松松针或柑橘叶片，无菌水清洗后漂放在水面或浸在水中，16℃～20黑暗放置.
2d～3d后开始检查，取有失绿或变色的松针或叶片，无菌水冲洗，灭菌滤纸吸干水分，放于选择性培养基PARP-V8或胡萝卜丝培养基上16℃～20C黑暗培养.如有真菌菌落出现，转到V8培养基 上纯化，16C~20℃黑暗培养.
4.2.3孢子囊培养
囊，48h后观察菌丝块周围孢子囊产生情况. 取纯化后菌落边缘菌丝块，置于盛有10mL无菌水的培养Ⅲ中，16℃～20C黑暗条件下诱发孢子
4.2.4卵孢子培养
将分离菌转至卵孢子培养基上.7℃～8C培养1周～2周，观察是否有卵孢子形成，
4.3分子生物学检测
4.3.1DNA提取
收集分离到的真菌菌丝，采用CTAB法提取核酸.参见附录C.
4.3.2PCR检测
采用引物PHIBI和PHIB2的特异性，检测从病菌基因组DNA中PCR扩增到的基因片段.
特异性引物 PHIB1 和 PHIB2 的序列分别为5'-TCGGGTCTGAGCTAGTAGTCTT-3′和 5'-CT-TCCACAACCAATTCCATTATGC-3'.
dNTPs 2 μl 10 μmol/L 引物各 0.5 μL 5 U/ yL Taq DNA 聚合酶 0.2 μL ddH; O 16.3 μl 反应体系（25pL）：样品DNA 1μL，10×PCR缓冲液2.5μL，25 mmol/LMgCl:2μL2.5mmol/L
反应条件为 94C 2 min;94°C30 s 68C30 s 72℃ 45 s，35个循环；72C 10min；4C保存.
在1×TAE电泳缓冲液中，1.5%琼脂糖（含SYBRGreenI核酸染料）凝胶电泳，5V/cm，凝胶成像仅分析结果.
4.3.3实时荧光PCR检测
可以选择荧光PCR检测.
实时荧光PCR引物序列为PH-F；5′-CGACTTGCCACCGGGA-3'和PH-R：5'-AACGGTACTTCTCTTTGCTCGAA-3′ TaqMan-MGB 探针 PH-Pr:5'-(FAM) TTCCACAACCAATTCCAT (NFQ-MGB)-3'，探针5端标记的荧光报告基团为FAM.3'端标记的非荧光猝灭基团为MGB.
反应体系(25 pL):样品 DNA 1 μL 10× PCR 缓冲液 2.5 μL 25 mmol/L MgCl 2 zL 2.5 mmol/LdNTPs 2μL10 μmol/L 引物各 1μL，10μmol/L 探针PH-Pr 1.5μL5 U/μLTaq DNA聚合酶 0.5 μL ddH;O 13.5 μL.
反应循环为94℃10min;94℃C15 s，56℃60s 循环40次.
5签定特征
5.1菌落特征
玫瑰花瓣状，花瓣状区域较宽且圆.V8培养基淡橘黄色.参见附录D. 冬生疫霉菌在V8培养基上生长速度较慢（4mm/d~8mm/d），菌落白色，平贴至中度的蓬松呈
5.2病菌形态
冬生疫霉菌的孢子囊长卵圆形或椭圆形，易脱落，顶部具有不完全的乳头状突起，通常基部锥形、顶部近半乳突处最宽.
73 μm 孢子囊大小（29μcm~53μm）×（14μm~22pm），长宽比较大，为1.8~2.4，孢囊柄长23μm~
孢囊梗不分枝或窄的长分枝，或形成不规则合轴式长侧枝.孢子囊低温萌发释放游动孢子，病菌不产生厚垣孢子，一般无菌丝膨大体.
该菌为同宗配合，雄器多围生，偶侧生，平均10μm×15μm：卵孢子黄橙色，满器，大小为22μm~45.6μm.壁厚 1 μcm~3μm:藏卵器大小为22μm~56μm.
孢子囊、雄器和卵孢子形态图参见附录D.
5.3与近似种的形态区别
冬生疫霉菌与丁香疫霉菌（Phytophthora syringae)在形态上很相似，主要区别为冬生疫霉菌落的花瓣区域较宽，孢子囊易脱落，雄器多围生：丁香疫霉菌落的花瓣区域较尖、窄，孢子囊不脱落，雄器多侧生，有菌丝膨大体.参见附录E.
5.4PCR特异性产物
引物PHIB1和PHIB2的特异性PCR扩增目的片段为407bp.
5.5实时荧光PCR检测
若阴性对照及空白对照的C值≥40，供试菌Ct值≤36，可判定为阳性.
6结果判定
病菌的培养性状和形态特征与5.1和5.2的描述一致且PCR检测结果或实时荧光PCR检测结果呈阳性，可判定为冬生疫霉菌.
