中华人民共和国国家标准
GB/T31798-2015
油菜黑胫病菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Plenodomus biglobosus（Shoemaker &H.Brun）Gruyter.Aveskamp&Verkley
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.本标准起草单位：中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、华中农业大学.本标准主要起草人：赵晖、王振华、曾宪东、易建平、李彬、李国庆、吴品珊、蔡翔.
油菜黑胫病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了油菜黑胫病菌（Plenodomuxbigloboszs）的检疫签定方法.本标准适用于油菜种子、植株及其产品中油菜黑胫病菌的检疫和鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3仪器设备和主要试剂
3.1仪器设备
生物显微镜、体视显微镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、涡旋振荡器.
3.2主要试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂，试验用水符合GB/T6682.
3.2.11%次氯酸钠
3.2.2DNA提取试剂：DNA提取试剂盒，异丙醇，无水乙醇.尿素提取液（7mol/LUrea.50mmol/L Tris-HClpH 8.0、62.5 mmol/L NaCl、1%SDS），蛋白酶K（20mg/mL)，苯酚三氯甲烷：异戊醇(25 24 = 1)溶液.3 mol/1 NaAc(pH 5.2).3.2.3PCR试剂：10×PCR缓冲液（含25mmol/LMgSO ），Tag酶，dNTPs.3.2.4凝胶电泳试剂：琼脂糖.TAE.1oading缓冲液，EB.3.2.520%V8培养基：V8蔬菜汁（Campbell Soup公司）200mL.CaCO 0.75g，琼脂粉13.0g，蒸馏 水定容至1000ml.，调整pH至5.8，121C高压灭菌20min.3.2.6马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯浸粉5.0g.葡萄糖20.0g，氯霉素0.1g，琼脂13.0g，蒸馏水定容至1000mL，调整pH至5.6，121C高压灭菌20min.
4病菌的鉴定
4.1症状检查
4.1.1种子症状检查
取样品量1%~5%（若样品少可适量增大比例>的种子，在解剖镜下挑选皱缩、干癌、变色、残缺的种子或有霉变的籽粒或病残体，每份种子样品挑选不少于500粒，用做病原菌的分离.另取1kg种子，
用孔径2.5mm和1.5mm的网筛过筛，取筛上物、筛下物和种子各1g~2g用于DNA提取.
4.1.2植株症状检查
取病变的植株的茎根部和叶部进行检查.主要检查茎根部和叶部.选取叶片上出现圆形或不规则形、稍凹陷、中部灰白色病斑、部分斑内散生许多小黑点症状的病变部位.植茎则选取不规则形淡褐色斑，或灰白色病斑、稍凹陷、上生黑色小点，或茎基及根系溃疡、枯萎症状的病变部位（参见附录A）.
4.2分离培养
4.2.1种子病原菌的分离培养
酸钠消毒5min~7min，无菌水洗涤3次后，用滤纸吸干种子，按25粒/Ⅲ置于V8培养基或PDA培养 将挑选的疑带菌种子置于灭菌蒸馏水中室温浸泡处理1d，转人一20℃下冷冻处理1d，1%次氯基上，在20℃~25℃，12h黑暗/12h光照（12h光暗交替）条件下培养，第3天开始观察.
4.2.2植株病原菌的分离培养
用解副刀取植株病健交界处的组织，剪成约0.4cm×0.4cm小段，用1%的次氯酸钠溶液消毒5min，无菌水洗涤3次，灭菌滤纸吸干水分后置于V8脂培养基或PDA培养基上，同6.2.1培养观察.
4.3鉴定特征
色的孢子溢出.气生菌丝呈白色或微黄、后期菌丝上会分泌出淡黄棕色的油状液滴，分生孢子呈长杆 该病菌在培养基上可良好生长，气生菌丝发达，产孢量大.后期（15d）可见到明显的孢子座和粉红形或梭形，长度在2.5pm~3.0pm之间，宽度在0.8pm~1.1μm之间.在孢子的两端各有一个透明的小液滴.PDA培养基会随着菌丝的生长呈黑色或黄色.该病菌在PDA上产生黄褐色色素.
4.4PCR 检测
4.4.1样品DNA提取
取筛上物、筛下物和种子，或植株可疑病变组织各1g~2g-液氮研磨后各取样0.1g~0.2g，采用商业化试剂盒或尿素法提取DNA（参见附录B）.
4.4.2PCR检测方法
对照，用灭菌蒸馏水作空白对照. PCR检测方法参见附录C，重复3次.用油菜黑胫病菌（Plen.biglobosns）参照菌株DNA作阳性
5结果判定
病菌的分离培养形态特征符合4.3中描述，可报告检出油菜黑轻病菌.PCR检测作为筛选和辅助方法.
6样品保存与结果记录
6.1样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存.对检出油菜黑胫病菌的样品应保存于4C冰箱中，以备复核.该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理.
6.2菌株保存与处理
培养基斜面上，20℃～25℃培养5d.然后4℃冰箱保存，或将菌丝块转人20%灭菌甘油并混匀， 从检测样品中分离并鉴定为油菜黑胫病菌的菌株，应妥善保存.将菌株接种于V8培养基或PDA一80℃长期保存.对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理.
6.3结果记录与资料保存
和审核人员签字，PCR凝胶电泳检测应有电泳结果照片. 完整的试验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并应有试验人员
