中华人民共和国国家标准
GB/T31802-2015
Detection andidentificationof Tomato spottedwiltvirus
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局. 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.本标准主要起草人：李桂芬、鲁洁、马洁、孔君、王秀芬、杜智欣、张永江、魏梅生.
番茄斑萎病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了植物检疫中番茄斑菱病毒的检疫鉴定方法.本标准适用于植物种子、苗木等繁殖材料中番茄斑萎病毒的检疫鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3仪器设备及试剂
3.1仪器设备
酶标仪、天平（感量1/10000g）、pH计、微量榨汁机、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、隔离温室、恒温水浴、低温冰箱等.
土等. 微量移液器（2μL，10μL，20μL，100μL，200pL，1000μL）、酶联板、研钵、离心管、花盆、灭菌
3.2试剂
酶联免疫吸附测定试剂见附录B.RT-PCR检测试剂见附录C，实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D.生物学测定试剂参见附录E.
4抽样与样品制备
4.1抽样
抽样按照SN/T2122的规定进行.
4.2种子样品制备
将种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播于灭菌土中，于25C生长并进行症状观察.待长出3片～4片叶后，将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为一组）并编号，采集叶片用于酶联免疫测定、RT-PCR检测、实时荧光RT-PCR检测及生物学测定.
4.3苗木样品制备
将苗木种植于隔离温室中，于25C生长并进行症状观察.有症状的苗木单独检测.没有症状的分组检测，分组方法和检测方法同4.2.
GB/T 31802-2015
5检疫鉴定方法
5.1酶联免疫吸附测定见附录B.
5.2RT-PCR 检测见附录C.
5.3实时荧光RT-PCR检测见附录D.
5.4生物学测定
参见附录E.
6结果判定
样品经酶联免疫吸附测定为阴性或RT-PCR检测为阴性或实时荧光RT-PCR检测为阴性，判断待检样品不携带番茄斑萎病毒.
样品经酶联免疫吸附测定为阳性，RT-PCR检测或实时荧光RT-PCR检测为阳性，即可判断待检样品携带番茄斑菱病毒.必要时可进行生物学测定.
7样品保存与结果记录
7.1样品保存
经检测确定携带番茄斑萎病毒的样品应在合适的条件下保存，种子可在4℃C保存1年，病株可在一20℃或一80C冰箱中保存1年，做好标记和登记工作.
7.2结果记录
完整的记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并应有经手人和实验人员的签字.酶联测定应有酶联板反应的原始数据，RT-PCR检测需有电泳结果图片，实时荧光RT-PCR应有反应原始数据生物学测定应有鉴别寄主的症状照片.
附录A
番茄斑萎病毒相关资料
A.1背景资料
A.1.1基本信息
番茄斑萎病毒学名：Tomarosportedwiltvirus，缩写：TSWV.分类地位：布尼亚病毒科（Baxnyaviridae），番茄斑菱病毒属（Tospovirus）.
A.1.2方法原理
列进行PCR特异性检测，通过电泳条带大小进行结果判定：根据该病毒核酸的序列设计特异性引物和 根据番茄斑萎病毒与抗体之间的特异性反应，对植物样品进行ELISA检测：根据该病毒核酸的序荧光探针，通过检测的荧光信号进行结果判定.条件允许的情况下，根据番茄斑萎病毒侵染寄主的症状特点，进行生物学检测.
A.2寄主范围
番茄斑萎病毒寄主范围非常广泛，包括温带、亚热带和热带的80多个科近千种双子叶和单子叶植物，可引起许多重要的园艺植物和农作物的严重病害，如花生、莴苣、番木瓜、豌豆、烟草、甜椒、番茄、秋海棠、菊花、大丽花等.
A.3病害症状
褐色的环斑或线纹斑，有的叶片上形成坏死斑，在叶柄和茎秆上产生黑色条纹.发病植株通常矮化或顶 番茄斑菱病毒侵染不同的寄主及农作物后所产生的症状各不相同，常见症状为叶片上产生黄色或枯，有的菱面最终死亡，
A.4分布
番茄斑萎病毒是一种分布广泛且具有经济重要性的植物病毒，分布于欧洲和地中海地区、亚洲、非洲、北美洲、中美洲和加勒比海、南美洲和大洋洲.
A.5传指方式
番茄斑萎病毒容易通过介体一蓟马以持久性方式进行自然传播，机械接种和嫁接也可传播，还可以随寄主植物种子、苗木等进行国际间传播，特别是这些寄主带有传毒介体时更容易传播该病毒.
A.6粒体形态
病毒粒子球形，表面有一层膜包裹，膜外面由厚5nm几乎连续的突起层组成，粒体直径80nm~120nm.
