中华人民共和国国家标准
GB/T31805-2015
Detection and identification of Cowpea severe mosaicvirus
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任. 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局.本标准主要起草人：陈青、李彬、方志鹏、黄峰、廖富荣、陈红运、林石明.
豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准适用于可能携带有虹豆重花叶病毒的植物繁殖材料（种子、植株）和产品的检疫鉴定. 本标准规定了豇豆重花叶病毒检疫鉴定的血清学、生物学和分子检测方法.
2仪器设备和主要试剂
2.1仪器设备
PCR仪、定量PCR仪、灭菌锅、制冰机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡震荡器、电泳仪、凝胶成像系统、微量研磨仪、酶标仪、洗板机、微量天平（感量：0.001g）、水平电泳槽、高速冷冻台式离心机、水浴槽、pH计、移液器（1000L、200L20L、2gL）、96孔酶标板、研钵等：防虫温室.
2.2主要试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯.PCR缓冲液、dNTPs（dATP、dTTP dCTP dGTP）、DNA聚合酶、引物和探针、琼脂.酶联检测试剂见附录B.
3检测样品的制备
3.1种子
挑取畸形种子播于灭菌土中，待长出3片～4片叶后，将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号.采集的叶片分成2份，根据需要分别用于酶联测定和分子检测.
3.2植株
和检测方法同3.1，双抗体夹心酶联免疫吸附测定. 有症状（如叶片畸形、花叶、斑驳等）的植株编号单独检测.没有症状的分组并编号检测，分组方法
4检测与鉴定
4.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定
两个孔中，设阴性对照和阳性对照[健康的植物组织作阴性对照，感染了CPSMV的植物组织作阳性对 把制备的样品上清液加入已包被CPSMV抗体的酶联板中，进行DAS-ELISA.每个样品平行加到照，其中阴性对照种类和材料（如种子或叶片）应尽量与检测样品一致]，样品提取缓冲液作空白对照，不同的检测试剂或试剂盒按说明操作.具体操作见附录B.
4.2 RT-PCR
分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增.健康的植物组织作阴性对照，感染CPSMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照.具体操作见附录C.
4.3IC-RT Real-time PCR
分别提取样品和对照的总RNA，进行IC-RTreal-timePCR检测.健康的植物组织作阴性对照，感染CPSMV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照.具体操作见附录D.
4.4生物学测定
样品按1：2~1：10（质量：体积）加人研磨缓冲液，在研钵中研碎.研碎后放人硅藻土（浓度为0.5%）并与病汁液混匀，接种到鉴别寄主上.具体操作参见附录E.
5结果判断
样品经DAS-ELISA、普通RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阴性时，判定样品未检出虹豆重花叶病毒.
样品经DAS-ELISA检测结果为阳性，进一步用RT-PCR或实时荧光RT-PCR方法进行检测.PCR结果为阴性，判定未检出虹豆重花叶病毒；PCR结果为阳性，可以判定为样品检出虹豆重花叶病毒.
6结果记录与样品保存
6.1结果记录
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字.酶联测定需有酶联板反应的原始数据；PCR检测需有电泳结果图片及序列测定分析结果；实时荧光PCR需要有荧光曲线图与Ct值；生物学测定应有鉴别寄主的症状照片.结果记录与资 料保存期限至少1年.
6.2样品保存
经检验确定携带CPSMV的样品应在合适条件下保存以备复核，种子保存在4C，病叶冻干保存在一20C或者一80C冰箱中，做好标记和登记工作.样品保存期限至少1年.
（资料性附录） 附录A 虹豆重花叶病毒相关资料
A.1背景资料
A.1.1豇豆重花叶病毒基本信息
学名：Coupea severe mosaic virus 缩写：CPSMV分类地位：虹豆花叶病毒属（Comroviras）成员.
A.1.2方法原理
亚豆重花叶病毒的分子生物学特性、血清学特性和生物学特性是本标准制定的主要依据.
A.2自然寄主
菜豆(Phaseolas vxgaris）大互（Glycine ma.）、绿豆（Vigna radiata）、亚豆（Vigna sinensis）、长豆（Vigna sesquipcdalis）、毛蔓豆(Calopogorium mncuneides），直生刀豆(Canaalia ensiformis）. 距瓣豆（Centrosemapubescens），麻（Crotalariajuxncea ），Desmodiuxm canescens，大翼豆(Macroprilim lath yroides) 四技(Psophocar pus tetragonolobus) Crotalaria paulinea
A.3病害症状
突起、畸形.一些寄主表现系统坏死.
大豆：在巴西，受侵染的大豆出现植株矮化、芽枯、结荚数减少、产量降低；毛蔓豆：出现严重花叶和疱状突起；距瓣豆：出现褪绿和花叶症状； 技麻：叶片出现褪绿斑驳和畸形或褪绿斑症状；绿豆：叶片出现轻花叶和坏死斑症状：虹豆：叶片出现褪绿花叶和严重畸形.
A.4分布
美国、特立尼达（特立尼达和多巴哥共和国）、波多黎各岛、萨尔瓦多、哥斯达黎加、委内瑞拉、苏里南、巴西、秘鲁、墨西哥.
A.5传播途径
