中华人民共和国国家标准
GB/T32951-2016
有机肥料中土霉素、四环素、金霉素与强力 霉素的含量测定高效液相色谱法
Determination of oxytetracylinetetracyline.chlortetracycline and doxycyclinecontent for organic fertilizers-HPLCmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.本标准由中国石油和化学工业联合会提出. 本标准由全国肥料和土壤调理剂标准化技术委员会（SAC/TC105）归口.本标准起草单位：上海化工研究院、上海出人境检验检疫局工业品与原材料检测技术中心、泰州市产品质量监督检验所、上海交通大学.本标准主要起草人：周辉、周韵、孙明星、商照聪、叶平、马明、闵红、沈国清、赵杰、洪丽玲.
有机肥料中土霉素、四环素、金霉素与强力 霉素的含量测定高效液相色谱法
警告：使用本标准可能会涉及到危险的材料、操作和设备但本标准无意对与其使用相关的安全问题都提出建议.使用者在应用本标准之前，有责任建立使用的安全和防护措施，并确定相关规章限制的使用性，
1范围
本标准规定了有机肥料中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素含量的高效液相色谱检测方法.
本标准适用于有机肥料、有机-无机复混肥料中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素含量的测定.
本标准不适用于豆饼肥中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素含量的测定.
本方法检出限分别为：土霉素0.75mg/kg.四环素0.75mg/kg金霉素1.0mg/kg强力霉素0.75 mg/kg.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
试样中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素经NaEDTA-Mellvaine-甲醇提取液提取、固相萃取小柱净化处理后进样，高效液相色谱紫外检测器测定，外标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.2乙晴：色谱纯. 4.1甲醇：色谱纯.4.3磷酸氢二钠（Na:HPO12HO）.4.4柠橡酸（CHOHO）.4.5乙二胺四乙酸二钠（NaEDTA2H（）. 4.6水合草酸（CHO2HO）.4.7磷酸氢二钠溶液：0.4mol/L.称取143.26g磷酸氢二钠，用水溶解，定容至1000mL4.8柠橡酸溶液：0.2mol/L.称取42.03g柠檬酸，用水溶解，定容至1000mL.
4.9乙二胺四乙酸二钠（NaEDTA）溶液：0.1mol/L.称取37.22g乙二胺四乙酸二钠，用水溶解，定容至1000 mL4.10磷酸氢二钠-柠檬酸（Mellvaine）缓冲液（pH=6.8±0.05）：将1 000mL0.4mol/L磷酸氢二钠溶 液（见4.7）与294mL0.2mol/L柠橡酸溶液（见4.8）混合.4.11NaEDTA-Mellvaine-甲醇提取液：取NaEDTA（见4.9），磷酸氢二钠-柠橡酸（Mellvaine）缓冲液（见4.10）与甲醇按112（体积）比例混匀，必要时用NaOH溶液或HC1溶液调节pH=7.20土0.05.4.12草酸溶液：0.01mol/L..称取1.26g草酸，用水溶解，定容至1000mL.4.13甲醇-水（119）：量取5mL甲醇与95mL水混匀. 4.14草酸-甲醇溶液：0.01mol/L.称取0.13g草酸，用甲醇溶解，定容至100mL.4.15土霉素（oxytetracyclineCAS：2058-46-0）、四环素（tetracyline，CAS：64-75-5）、金霉素（chlortet-racycline，CAS：64-72-2）、强力霉素（doxycycline，CAS：24390-14-5）标准物质：纯度92%~98%.4.16土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准储备溶液：2mg/mL，准确称取一定量的土霉素、四环素、保存. 金霉素、强力霉素标准物质（见4.15），分别用甲醇配成2mg/mL的标准储备液.储备液于0℃C～8℃C4.17土霉素、四环素、金霉素、强力霉素混合标准溶液：分别取5mL土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准储备液（见4.16）至100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，每种物质浓度为100μg/mL，储存于冰箱中，每周配制.使用前依次通过2mL甲醇及2mL水预处理，保持柱体湿润.
5仪器和设备
5.1液相色诺仪：配紫外检测器.5.2分析天平：感量0.1mg.5.3机械振荡提取仪；50次/min~500次/min.5.4冷冻离心机：转速大于3500r/min5.6真空泵. 5.5固相萃取装置.5.7氮气吹干仪.5.8pH计：测量精度士0.02.5.10金属试验筛：0.5mm. 5.9针式过滤头：0.22cm.
6试样制备与保存
将样品粉粹，全部通过0.5mm试验筛，待用.
过筛的实验室样品在室温（约25℃）下避光保存，并注意防潮防霉.
7分析步骤
7.1称样
称取过筛的试样1.0g~2.0g.精确至0.1mg.
7.2提取
试料置于50mL带盖塑料离心管中.向试料中加人20mLNaEDTA-Mellvaine-甲醇提取液，于3500r/min，离心10min，取上清液至另一离心管中.残渣中再依次加人20ml、10mLNaEDTA- 机械振荡提取仪中室温（约25C）下提取20min，于15℃下置于离心机上离心速度不小于Mellvaine-甲醇提取液，重复提取两次，合并上清液并定容至50mL.
7.3净化
从定容的50mL上清液中取5ml置于氮气吹干仪上，室温（约25C）下吹至原体积的一半左右，5mL甲醇-水淋洗固相萃取柱，弃去全部流出液.减压抽干5min.用5mL草酸-甲醇溶液洗脱目标物. 加适量水稀释至体积约5mL.以1mL/min的速度通过已活化处理的固相萃取柱.依次用5mL水，洗脱液使用饱和NaOH溶液调至pH约为5~6，置于氮气吹干仪上吹至近干，用1mL水溶解残渣，过0.22pm滤膜，按7.4.3.1测定一进行测定.
骤后，过0.22pm滤膜按照7.4.3.2测定二进行测定. 当有机肥样品中基体及杂质对目标物色谱峰没有影响时，可省略7.3净化步骤，试样经7.2提取步
7.4测定
7.4.1液相色谱参考条件
推荐的液相色谱条件如下：
a）色谱柱：C18柱，2.7pm4.6mm×100mm或相当者：c)流速：1.0mL/min; b）流动相及梯度洗脱条件：见表1；d）柱温：30℃：e) 检测波长：355nm；f) 进样量：20pL.
表1流动相及梯度洗脱条件
时间/min 流动相[乙睛（4.2）]/% 流动相[0.01 mol/L草酸(4.12)]/% 流动相[甲醇（4.1）]/%848 15 8 70 15 810 1516 70 1517 8 84 825 8 84 8
