中华人民共和国国家标准
GB/T33120-2016
Detection and identification ofPearblister canker viroid
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.
本标准起草单位：中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、中华人民共和国中山出人境检验检疫山东出人境检验检疫局、中华人民共和国检验检疫科学研究院、华中农业大学植物科技学院.
本标准主要起草人：王振华、陈定虎、叶芸、徐文兴、徐家文、曾宪东、徐雪、张永江、王、李曼、王英超、吴兴海.
梨疱状溃疡类病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了梨疱状溃疡类病毒的检疫鉴定方法.本标准适用于进出境梨树种苗、组培苗及植株中梨疱状溃疡类病毒的检疫和鉴定.
2梨疱状溃疡类病毒基本信息
学名Pear blister canker viroid
缩写：PBCVd
异名：梨泡斑类病毒.
分类地位：马铃薯纺锤块茎类病毒科（Pospiviroidae），苹果锈皮类病毒属（Apxcaviroid）.
传播途径：通过嫁接、芽接和刀具机械传播，但没有有关介体及种子传毒的报道.远距离通过种苗调运传播，
梨疱状溃疡类病毒的其他信息参见附录A.
3方法原理
根据梨疱状溃疡类病毒全长RNA核酸链中的保守区域设计了一对扩增该类病毒全长核酸的引物，进行RT-PCR扩增和序列测定；根据梨疱状溃疡类病毒全长核酸序列设计与正单链RNA互补的单 链RNA探针，通过杂交信号强弱进行结果判定，
4仪器设备和主要试剂
4.1仪器设备
超净工作台、灭菌锅、制冰机、高速冷冻离心机、超低温冰箱、常规冰箱、涡旋振荡器、微量进样器、垂直电泳槽、PCR仪、凝胶成像系统、杂交炉、交联仪、杂交管、化学发光检测仪等.
4.2主要试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯.RT-PCR试剂见附录B：分子杂交试剂见附录C
5症状观察
取样品量1%~5%（若样品少可适量增大比例）的种苗进行检查.检查梨疱状溃疡类病毒侵染症状，树皮上形成疱状物或树皮开裂、溃疡、鳞状表皮或表皮深裂，树势衰退.
GB/T 33120-2016
6实验室鉴定
6.1RT-PCR检测
RT-PCR检测见附录B.
6.2分子杂交检测
分子杂交检测见附录C.
7结果判定
在每次检测中阴性对照和空白对照均表现为阴性，而阳性对照表现为阳性，则说明检测体系可靠，品中带有梨疱状溃疡类病毒：如果RT-PCR检测和杂交检测结果均为阴性，则可确定样品不带有梨癌 在此条件下，如果样品经RT-PCR和分子杂交两种检测方法均为阳性反应，并经测序验证，则可判定样状溃疡类病毒.
8样品保存
8.1样品保存与处理
棚种植隔离保存，同时一70C超低温保存，以备复核，该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理. 样品经登记和经手人签字后妥善保存.对检出梨疱状溃疡类病毒的样品应嫁接在砧木上，温室大
8.2结果记录与资料保存
借酸测定序列、分子杂交检测结果图片等，并要有实验人员和审核人员签字. 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法、RT-PCR检测结果图片、核
附录A
（资料性附录）
A.1地理分布
法国、西班牙、意大利、日本、希腊、突尼斯、马耳他、阿根廷、中国（湖北和新疆).
A.2寄主范围
目前报道的寄主范围限于蔷薇科（Rosaceae）的梨属（Pyrux）、苹果属（Malas）和山植属（Crataegux）植物，梨属种包括杜梨（P.berxlifolia）、豆梨（P.calleryana）、西洋梨（P.munix）、沙梨（P.serotina）雪梨（P.nialis）等；苹果和山楂属的个别种如山丁子（M.baccata）、八棱海棠（M.rouxta） 和山楂（C.monogyna）等.
A.3基因组特征
梨疱状溃疡类病毒为一共价闭合环状的单链RNA分子，长约314个碱基.
序列（NCBI登陆号：NC_001830）如I下：
CUUUCCUGAGGUUCCUGUGGUGCUCCCCUGACCUGCGUUCCAAAAAGCGAAAAAGUGAGAGGCCCUGUGAGUAAUCGCUCCUUUGGAGAAGAAAACCAGCGUUGCUUOCUGCCUGAGCCUCGUCUUCUG AGGGGCUUCUOGGCUOGUCGUCGACGAAGGGUCUAGAAGCUUGGGCGCUGGCUGGAGCGCGCGGCUUCCCGCUAGUOGAGCGGACAACCCGAGCACCGCCGAAGCGCUUUUUUCUUUUAUAGCAGCUUGGCUUCGCGGCGAGGGUGGAAGUUUACCGCGGACCCCCGAGAGGAGGCCCUCGGGUCC
A.4症状
症状.在一些敏感品种上仅在树皮上表现症状，侵染的第二年在树皮上形成疮状物或树皮开裂，并逐步 梨疱状溃疡类病毒能潜伏侵染很多西洋梨（P.manis）商业品种，叶片及果实不表现任何病理转变为溃疡、鳞状表皮或表皮深裂，进面树势衰退，导致梨树得病后5年～8年死亡，图A.1为该病毒在不同梨品种枝干上的溃疡症状.
生 ： 自 http: / / -intranet angers inrn fr/dossiers/virus/fichvir3 html
图A.1梨疤状溃疡类病毒在不同梨品种枝干上的溃疡症状
