中华人民共和国国家标准
GB/T33127-2016
Detection and identification of Sugarcane streak virus
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国海南出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：冯黎霞、武目涛、刘福秀、赵立荣、王卫芳、杨雷亮.
甘蔗线条病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了甘蔗线条病毒的检疫鉴定方法，本标准适用于可能带有甘蔗线条病毒的活体寄主植物的检疫鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3甘蔗线条病毒基本信息
中文名：甘蔗线条病毒.缩写：SSV.甘蔗线条病毒的其他信息参见附录A.
学名：Sugarcane streak viras.
分类地位：双生病毒科（Geminioiridae），玉米线条病毒属（Mastrevirus）.
4方法原理
SSV的免疫原性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据.利用常规PCR、实时荧光PCR、双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）和免疫电镜方法对样品进行检测.
5仪器设备、设施、用具和试剂
5.1仪器
电子天平（感量0.001g）高速离心机、小型瞬时离心机、超低温冰箱（一80℃）、制冰机、涡旅振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、透射电子显微镜、超净工作台、PCR仪、实时荧光定量PCR仪、微 波炉、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析仪、酶联检测仪.
5.2设施
隔离温室（10℃~30℃）.
5.3用具
酶联板、可调移液器（2.5L、10μL、20μL、100μL、1000μL）和可调移液器头、离心管、研钵、微型
磨样等.
5.4试剂
除有特别说明外，试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定.DAS-ELISA测定试剂见附录B：PCR检测试剂见附录C；实时荧光PCR检测试剂见附录D.
6症状观察与抽样
6.1症状观察
现场检疫主要观察植物材料上病毒为害的症状，SSV为害症状描述参见附录A.
6.2抽样
发现有病毒为害症状的植物材料直接送检；未发现症状的，则按SN/T2122中规定进行抽样，并送实验室检测鉴定.
7实验室检测
7.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）
对待检组织进行研磨，并按1：10（质量：体积）的比例加入抽提缓冲液，制备的汁液分别盛装于离心管中，离心后吸取上清液作为待测样品，并设阳性对照、阴性对照和空白对照.具体操作步骤见附 “日
7.2常规PCR检测
DNA后进行常规PCR检测，具体操作步骤见附录C. 植株叶片液氮研细，取0.1g用于提取植物总DNA，双蒸水作为空白对照.分别提取样品和对照的
7.3实时荧光PCR检测
实时荧光PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1，双蒸水作为空白对照.分别提取样品和对照的DNA后进行实时荧光PCR检测，具体操作见附录D.
7.4免疫电镜检测
按照SN/T1840中规定的方法制备样品和进行电镜观察病毒粒子形态.在免疫电镜下如观察到大小为30nm×20nm的杆状双联体粒体，即可判定结果阳性.
8结果判定
样品检测时，检测结果判定按下述原则进行：
-样品经PCR检测为阴性；或者样品经PCR检测为阳性，但是序列测定结果与目的序列不一致，则判定样品不携带甘蔗线条病毒.这三种检测方法其中一种为阳性检测结果，即可判定样品携带甘蔗线条病毒.
样品经PCR检测为阳性，且序列测定结果为目的序列：同时免疫电镜、DAS-ELISA、荧光PCR
9样品与记录结果保存
经检验确定携带甘蔗线条病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核，实验样品保存在一20℃冰箱中，有条件的保存在一80℃冰箱中更好，做好登记和标记工作.
记录包括样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检验检疫员的签字等，双抗付夹心酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的数值，PCR检测应有电泳结果照片.
