中华人民共和国国家标准
GB/T33410-2016
Determination of the activity of protease K in biochemical reagents
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口. 本标准起草单位：深圳市计量质量检测研究院、中国测试技术研究院、中国标准化研究院.本标准主要起草人：林霖、周李华、赣心田、兰全学、马爱进、陈国培、李浙、潘兰芳、杨国武.
生化试剂中蛋白酶K活性检测方法
1范围
本标准规定了生化试剂中蛋白酶K活性检测方法.本标准适用于分子生物学实验中使用的蛋白酶K活性的测定，
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1
蛋白酶K活性单位proteaseK activity unit
在55C，pH 8.0时，1min内水解酪蛋白产生1μgL-酪氨酸为一个酶活性单位.
注：活性单位为 U/mg、U/g或 U/ml.
4原理
蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，可催化含有较多的丝氨酸位点的α酪蛋白水解.本方法中采用α-酪蛋白为反应底物，经蛋白酶K催化水解为L-酪氨酸，在275nm处测定吸光度值.再以外标法定量.计算蛋白酶K的酶活性. 通过测量各个浓度的L-酪氨酸标准溶液在275nm处的吸光度值，并构建标准曲线得出线性回归方程，
5仪器设备及器具
5.1恒温水浴锅：控湿精度土0.2℃. 5.2pH计：精确至0.01pH.5.3紫外-可见分光光度计：吸光度值精确至0.001.5.41cm石英比色Ⅲl.5.5电子天平：感量0.0001g
6试剂
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6882规定的三级水.
6.10.01 mol/L Tris HCI缓冲液（pH 8.0)
1 mol/LTrisHCI缓冲液，用浓盐酸调至pH8.0；再取1mL1mol/LTrisHCl缓冲液加去离子水 称取12.11gTrisbase（三羟甲基氨甲烷盐酸盐）加人适量去离子水使其溶解，定容到100mL，得定容至100ml，即得0.01mol/LTrisHCl缓冲液.
6.20.4mol/L三氯乙酸溶液
称取三氯乙酸65.40g，用去离子水溶解并定容至1000mL.
6.3HCI溶液
量取 10.00 mL 1 mol/L HC1加去离子水定容至 100 mL，得0.1 mol/1 HC1.
量取8.33mL浓盐酸加人到50mL去离子水中，定容至100mL，得1mol/LHCl.
6.40.5 mol/L NaOH溶液
称取2gNaOH，溶解于50ml去离子水中，定容至100mL.
6.510g/L酪蛋白溶液
称取酪蛋白标准品 1.000 g，用少量0.5mol/L NaOH溶液（6.4）湿润后，加人0.01mol/LTisHCI0.01mol/LTrisHCl缓冲液（6.1）定容至刻度，置于4C保存备用. 缓冲液（6.1）约80mL，在沸水中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转移至100mL容量瓶中，用适量
6.6100μg/mLL-酪氨酸标准储备液
容至 100mL，配成1mg/mL. 1-酪氨酸标准溶液.再吸取1mg/mL L-酪氨酸溶液10.00 mL 用o.1mol/L 称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，用60mL1mol/1.HC1溶液（6.3）溶解后定盐酸溶液（6.3）定容至100mL，即得到100pg/ml的L-酪氨酸标准储备液.注意避光保存.
7分析步骤
7.1标准曲线的绘制
7.1.1L-酪氨酸标准溶液
按表1配制L-酪氨酸标准溶液.
表1L-酪氨酸标准溶液配制
曾号 酪氨酸标准溶液的浓度 加人 100μg/ml.酪氨酸标准溶液的体积 加人去高子水的体积μg/ml. mL ml.0 0 0 101 20 2 82 40 4 63 60 45 4 100 80 10 8 2
7.1.2吸光度值的测定
其吸光度（A）. 用紫外分光光度计，在275nm波长下，以不含酪氨酸的0号管为空白，用1cm石英比色Ⅲ，测定
7.1.3吸光常数K值计算
归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值.K值应在130~135范围内. 以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度：为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）.得出线性回
7.2测试过程
7.2.1待测酶液制备
0.01mol/LTrisHC1缓冲液（6.1）稀释，使待测酶液比活力处于（0~160)U/g或U/mL之间. 称取1g（精确至0.001g）或吸取1mL（精确至0.001ml），根据结合样品具体情况，使用适量的
7.2.2空白对照试验
将10g/L酪蛋白溶液（6.5）放人55℃恒温水浴中，预热5min.
摇匀，55C温浴5min：加10g/1.酪蛋白溶液（6.5）2.00mL.摇匀，取出静置5min，过滤. 加人0.01mol/1 Tris HCI缓冲液（6.1)，55C温浴2 min;加 0.4 mol/L三氯乙酸(6.2）4.00mL，
加等量滤液至1cm石英比色Ⅲ，用紫外分光光度计于275nm处调零.
7.2.3样品测试
将10g/L酪蛋白溶液（6.5）放人55C恒湿水浴中.预热5min.
加待测酶液（7.2.1）2.00mL，55C温浴2min：加10g/L酪蛋白溶液（6 5）2.00mL，摇匀，55C温浴5min：加0.4mol/L三氯乙酸（6.2）4.00mL，摇匀.取出静置5min，过滤.
准曲线范围内. 加等量滤液至1cm石英比色Ⅲ，用紫外分光光度计测定275nm处吸光度值，吸光度值应处于标
每个样品设置两个平行样.
8计算
8.1结果计算
按式（1）计算酶活：
式中：
X为酶的比活力U/mg或U/mL：8-反应总体积为8mL: N-为275nrm吸光度值带入L-酪氨酸标准曲线的公式中计算而得产生的L-酪氨酸浓度（μg/mL）；5--反应水浴时间为5min，酶活单位定义以1min计；d一-酶反应液中所含原酶粉质量（mg）或原酶液体积（mL）.
8.2质量控制
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%.
