中华人民共和国国家标准
GB/T33412-2016
Determination of hydroxycitric acid in biochemical productsHPLCmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口.本标准起草单位：上海市计量测试技术研究院.本标准主要起草人：刘刚、李兰英、丁敏、闻艳围、徐勤、许丽.
生物制品中羟基柠檬酸的测定 高效液相色谱法
1范围
本标准规定了用高效液相色谱法测定保健（功能）类生物制品中羟基柠檬酸含量的方法.本标准适用于口服液、胶囊、题粒冲剂等生物制品中羟基柠檬酸的测定.
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
试样中羟基柠橡酸用水提取，经离心后，上清液经0.45um微孔滤膜过滤，经高效液相色谱分离，紫外检测器检测，外标法定量，测定羟基柠檬酸的含量.
4试剂和溶液
除另有说明，本方法使用的试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：色溶纯.4.3体积分数0.1%磷酸水溶液：准确吸取1mL分析纯磷酸，用水稀释并定容至1000mL. 4.2磷酸.4.4羟基柠橡酸标准品（CAS号：6205-14-7）：纯度≥98%4.5羟基柠檬酸标准储备液：准确称取1g（精确至0.001g）经过95℃土2C干燥2h的羟基柠檬酸标准品，加适量水溶解，转移至100mL容量瓶中，用水定容，摇匀.羟基柠檬酸标准储备液浓度 为10 000 mg/mL.4.6羟基柠橡酸标准溶液：使用前，将10.000mg/mL的羟基柠檬酸标准储备液用水逐级稀释，制成浓度为 1.000 mg/mL、 0.500 mg/mL 0.200 mg/ml、0.100 mg/mL 0.010 mg/mL、0.001 mg/mL 的羟基柠檬酸标准溶液，
5仪器与设备
实验室常规设备及下列各项：
5.1高效液相色谱仪：配紫外检测器. 5.2分析天平：感量0.01g0.001g.5.3高速离心机：10000g5.4滤膜：0.45μm，水相.
GB/T 33412-2016
5.5超声波清洗器，5.6研钵.5.7常用玻璃量器，A级.
6试样的制备
6.1固体试样
从研磨成粉末（胶囊取胶囊内容物）的混匀试样中称量1.0g试料（精确至0.01g），置于烧杯中，加水40mL，超声波清洗器100W超声20min，冷却至室温后转移至50mL容量瓶，并加水定容.
6.2液体试样
从试样中准确移取试料1.00mL 加水稀释并定容至10ml.上述上清液即为试料溶液.
7分析步骤
7.1液相色谱参考条件
色谱柱：AtlantisT3C色谱柱（150mm×4.6mm，5μm），或相当者；流动相：0.1%磷酸水溶液甲醇，体积比（991）； 流量：0.6mL/min;柱温：室温：检测波长：210nm:进样量：10gL.
7.2绘制标准曲线
分别吸取羟基柠檬酸系列标准溶液，用0.45gm滤膜过滤，注人高效液相色谱仪，进样10pL，进行测定，以各标准溶液浓度峰面积为纵坐标，以标准溶液标准浓度值为横坐标，绘制标准曲线，并关联获得标准曲线公式，标准曲线的相关系数应该不小于0.999.羟基柠橡酸标准品色谱图参见附录A中图 A.1.
7.3样品分析
吸取试料溶液（6.2），用0.45um滤膜过滤，注人高效液相色谱仪，在7.2相同条件下进行测定，根据色谱峰面积，利用线性回归方程计算试料溶液中羟基柠檬酸的含量，典型样品色谱图参见图A.2.
8结果计算
8.1固体试样
固体试样中羟基柠檬酸的含量（质量分数）按式（1）和式（2）计算：
（1）
.( 2)
式中：
p -从标准曲线求得试料的质量浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）：A 试料的色谱峰面积（高）： 标准曲线截距：6 标准曲线斜率；一样品中被测组分质量分数，单位为毫克每克（mg/g）；V试料溶液定容体积，单位为毫升（mL）；m；-称取试料的质量，单位为克（g）.
8.2液体试样
液体试样中羟基柠檬酸的浓度按式（3）计算：
(3)
式中：
V.-移取试料的体积，单位为毫升（mL）.
p.--试样中被测组分质量浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL)；
9方法特性
9.1测定范围
进样10μL.在相关系数大于或等于0.999的前提下，羟基柠檬酸的线性测量浓度响应范围为0.001 mg/mL~1.000 mg/mL.
9.2回收率和精密度
参见附录B.
