中华人民共和国国家标准
GB/T33420-2016
Evaluation standard of biological for moist heat sterilization processes
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会提出并归口，
本标准起草单位：中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、中国人民解放军疾病预防控制所、山东新华医疗器械股份有限公司、中国医学科学院协和医院、山东利尔康消毒科技股份有限公司、3M中国有限公司、杭州鲁沃夫货物进出口有限公司.
马玲、班海群. 本标准主要起草人：张流波、张剑、姚楚水、张青、王妍彦、沈瑾、黄靖雄、朱晓明、朱汉泉、史绍毅、
压力蒸汽灭菌生物指示物检验方法
1范围
本标准规定了压力蒸汽灭菌生物指示物的检验方法.本标准适用于压力蒸汽灭菌生物指示物的检验.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文GB18281.1医疗保健产品灭菌生物指示物第1部分：通则GB/T24628医疗保健产品灭菌生物与化学指示物测试设备消毒技术规范（2002年版）卫生部
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
生物指示物biologicalindicator:BI
对指定条件下的特定灭菌程序具有一定抗力，并装在内层包装中可供使用的染菌载体.
3.2载体carrier试验微生物的支持物.
存活时间survival time;ST 在规定的条件下暴露于杀菌因子，试验的生物指示物中微生物存活的最长时间.
测定生物指示物抗力时，受试样本经杀菌因子作用后，全部无菌生长的最短作用时间.
D值Dvalue在设定的暴露条件下，条灭特定试验微生物总数的90%所需的时间.
存活曲线survivorcurve在固定的灭菌因子作用下，微生物的存活情况与暴露变化的关联曲线.
3.7生物指示物抗力测试仪biologicalindicatorevaluatorresistometer产生限定条件下灭菌过程中物理化学变化规定组合，以测量抗力的专用设备.
4检验指标与方法
4.1抗力
4.1.1菌种
用于制作压力蒸汽灭菌生物指示物的菌株为嗜热脂肪杆菌芽孢（GeobacilluxxtearothermophilusATCC7953或SSIK31)或被证明具有本标准所要求的同等性能的微生物.
4.1.2菌量
回收菌量大于等于1X10°CFU/片或大于等于1X10CFU/支，对于成品的指示物，载体回收的菌量与说明书上的菌量误差在一50%～300%之间，悬液回收的菌量与说明书上的菌量误差在士35%.测定菌量时，应最少测试4个样本，具体检测方法参见附录A.
4.1.3D值
测试抗力时应使用生物指示物抗力测试仅，生物指示物抗力测试仪要求见GB/T24628.在121C时，D值的要求：D值大于或等于1.5min，对于成品的指示物，测试的D值应在说明书上的D值 土20%的范围内.应至少使用下列2种方法进行测试：
a）存活曲线法测试D值，参见附录B；b）部分阴性法测试D值，参见附录C；c）验证法测试D值，将a）或者b）测试出的D值和4.1.2的回收菌量的平均数带人式（1）和 式（2），计算出ST值和KT值，参照附录D进行验证：
ST≥（logN.-2)×D值KT ≤ (logN. 4)× D 值
式中：
4.1.4存活时间与杀灭时间
在121C时，ST值的要求：大于或等于4.5min：KT值的要求：小于或等于24min.
4.2载体的要求
符合GB18281.1的要求.
4.3恢复培养基的要求
4.3.1恢复培养基应满足下列要求：
a）使10CFU~100 CFU的微生物恢复生长： b）使损伤的微生物恢复生长：c）经过压力蒸汽灭菌后不会产生抑制微生物生长的物质.
4.3.2恢复培养基按以下方法检验：
每个样本的恢复培养基中，接种10CFU~100CFU的嗜热脂肪杆菌芽孢（ATCC7953），同时设置阴性对照和阳性对照，培养至规定时间后观察有无嗜热脂肪杆菌芽孢生长（一般观察培养基的颜色变化）.如果恢复培养基有菌生长，并且阴性对照无菌生长和阳性对照有菌生长，判断恢复培养液合格.
4.4稳定性试验
取包装完好的同批次生物指示物放置于制造商建议的保存条件下，存放至标签和说明书规定的有效期限，取出再次进行评价，生物指示物应符合4.1、4.2和4.3的要求.
附录A
（资料性附录）
活菌培养计数方法
A.1取含有10mLTPS（0.1%胰蛋白陈的生理盐水溶液）的无菌试管，加人适量无菌玻璃珠，将计数菌片投人试管，用电动混合器混合，到菌片被完全打碎，制成菌悬液.10、10等. A.2将试管按需要数量分组排列于试管架上，每管加人4.5mLTPS.各组由左向右，逐管标上10、A.3将菌悬液用电动混匀器混合20s，或在手掌上用力报打80次，随即吸取0.5mL加至10-管内.人10管内.如此类推，直至最后一管.必要时，还可作某稀释度的1：1或1：4稀释.A.5选择适宜稀释度试管（以预计生长菌落数每平板为15CFU~300CFU者为宜），吸取其中混合均 匀的悬液1.0mL加于无菌平Ⅲ内.每一稀释度接种2个平Ⅲ.一般需接种2个～3个不同稀释度.A.6将40℃～45C熔化的嗜热脂肪杆菌芽孢恢复培养基参见《消毒技术规范（2002年版）》，倾注于已加人样液的平Ⅲ中，每平Ⅲ15ml~20ml.A.7将平血盖好，即刻轻轻摇动混匀，平放.待琼脂凝固后，翻转平Ⅲ使底向上置56C土2C恒温培A.8培养至72h，计数菌落数.一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查.以每平板菌落数在30CFU~ 养箱内培养.300CFU的稀释度为准记录结果.A.9根据稀释倍数和接种量计算每毫升菌液中或每一菌片（染菌载体）上的平均菌落数.A.10菌液计数从A.3步骤开始操作.
