中华人民共和国国家标准
转基因植物及其产品成分检测 抗虫耐除草剂大豆DBN8002转化 体特异性PCR方法
Detection of genetically modified plants and derived productsEvent-specific PCRmethod for insect-resistant and herbicide-tolerantsoybean DBN8002
中华人民共和国农业农村部 发布
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由中华人民共和国农业农村部提出.
本文件由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口.
本文件起草单位：中国农业科学院油料作物研究所、农业农村部科技发展中心、北京大北农生物技术有限公司.
本文件主要起草人：武玉花、王题潜、李俊、姚晓青、汤波、高鸿飞、谢香庭、孙宇、王磊、李允静、黄耀辉、肖芳、翟杉杉、呼倩、吴刚.
转基因植物及其产品成分检测
抗虫耐除草剂大豆DBN8002转化体特异性PCR方法
1范围
本文件规定了抗虫耐除草剂大豆DBN8002转化体特异性PCR定性和定量检测方法. 本文件适用于大豆及制品中DBN8002转化体成分的定性和定量检测.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，文件.
农业部2031号公告一8-2013转基因植物及其产品成分检测大豆内标准基因定性PCR方法
NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求
3术语和定义
农业部2031号公告一8一2013界定的以及下列术语和定义适用于本文件.
3.1
抗虫耐除草剂大豆DBN8002转化体特异性序列event-specific sequence of insect-resistant and her-
bicide-tolerant soybean DBN8002
抗虫耐除草剂大豆DBN8002转化体的外源插人片段5端或（和）3'端与大豆基因组的连接区序列，包括大豆基因组部分序列及转化载体T-DNA部分序列.
3.2
阳性质控品positive control
用于质量控制的阳性样品，分为用于定性检测的阳性定性质控品和用于定量检测的阳性定量质控品.注：阳性质控品宜优先选用有证标准物质，也可使用经充分验证的实验室配制样品.阳性定性质控品的转基因含量为0.1%~1%，期性定量质控品的转基国含量宜与标识阔值相当.
校准品calibrator
用于绘制标准曲线的梯度稀释样品用纯合转化体基因组DNA或转基因含量较高的有证标准物质
或阳性样品的DNA稀释制备，确认后至少含5个有效浓度.宜优先选择有证标准物质.
3.4
子样subsample
试样预处理后，从同一试样不同位置随机抽取的独立样品.
3.5
△C值△Cr value
实时荧光PCR扩增中样品转化体特异性序列平均C值与内标准基因平均C:值的差值.
AACr值AACr value
实时荧光PCR扩增中试样的△C值与阳性定量质控品的△C值的差值.
4通用要求
4.1检测方法
（方法一）、实时荧光PCR定量检测方法（方法二）、普通PCR定性检测方法（方法三）3种方法，可根据实 第5章至第7章分别规定了抗虫耐除草剂大豆DBN8002转化体成分的实时荧光PCR定性检测方法际检测需求选用.
4.2试剂、材料、模板
第5章至第7章规定的3种不同方法间的试剂、材料、试样模板、质控品模板，在满足检测条件的情况下可以通用.
5实时荧光PCR定性检测方法（方法一）
5.1原理
采用规定的引物和探针对试样中大豆内标准基因和抗虫耐除草剂大豆DBN8002转化体特异性序列，进行实时荧光PCR扩增.依据是否扩增获得预期的典型扩增曲线，判断试样中是否含有抗虫耐除草 剂大豆DBN8002转化体成分.若试样中含有抗虫耐除草剂大豆DBN8002转化体成分，计算试样与阳性定量质控品的△△C值，判定试样与阳性定量质控品相比转化体成分含量的高低.
5.2试剂和材料
除非另有说明，仅使用分析纯试剂、蒸馏水或以上等级的水.5.2.1DNA提取试剂盒.5.2.2PCR扩增试剂：Tag DNA聚合酶、PCR扩增缓冲液、25mmol/L氯化镁（MgCl）溶液、dNTPs溶 液（浓度为10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP4种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合）.注：若不采用上述PCR扩增试剂，也可选用实时荧光PCR试剂盒，
5.2.3大豆内标准基因Lecrin基因引物/探针
Iee-1215F;5′-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3′;Iee-1269P:5'-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-3'. lee-1332R:5′-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3′;注1：预期扩增片段大小为118 bp.注2:lee-1269P 为Lertin基因的 TaqMan 探针，其5编标记荧光报告基团（如FAMHEX等）.3编标记对应的茨光摔[来源：农业部2031号公告-8-2013，5 13] 灭基闭(如 TAMRA、BHQ1等）.
5.2.4抗虫耐除草剂大豆DBNB002转化体特异性序列引物/探针
DBN8002-QF :5'-TATCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTC-3′;DBN8002-QR:5′-TGTCATTCCTCAAGTGTCCCAT-3′:注1:预期扩增片段大小为104 bp（见附录A中的A.1). DBN8002-QP:5'-TGTGTAACGCTTGTTTTGCTAT-3'注2：DBN8002-QP为抗虫耐除草剂大豆DBN8002转化体特异性序列的TaqMan探针，其5'编标记荧光报告基团（如
FAM.HEX等）3'端标记对应的荧光摔灭基团MGB
5.2.510mol/1氢氧化钠（NaOH）溶液：在160ml水中加人80.0g氢氧化钠，溶解后，冷却至室湿，再加水定容至200mL.
5.2.6500mmol/1乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na-）溶液（pH8.0）：称取18.6g乙二胺四乙酸二钠，加人70mL水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液（见5.2.5）直至乙二胺四乙酸二钠完全溶解，用氢氧化钠溶液（见5.2.5）调pH至8 0，加水定容至100mL.在103.4 kPa（121℃）条件下灭菌20 min.
5.2.71mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCI）溶液（pH8.0)：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷溶解于800 mL水中-用盐酸（HC1）调pH至8 0.加水定容至1 000mL.在103.4 kPa（121 C）条件下灭菌 20 min.2
