YC/T628-2025
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。
本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由国家烟草专卖局提出。
本文件由全国煤草标准化技术委员会农业分技术委员会（SAC/TC144/SC2）归口。
本文件起草单位：郑州烟草研究院、贵州省烟草科学研究院、中国农业科学院烟草研究所、云南省 烟草农业科学研究院。
本文件主要起草人：张剑锋、金静静、罗朝鹏、余世洲、任民、童治军、许亚龙、谢小东、李泽條、徐馨、 卢鹏、陶界锰、武明珠、王中、李锋、杨军、曹培健、谢贺、白戈、肖炳光、杨爱国、雷波、杨志晓、赵会纳。
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烟草品种鉴定技术规程SNP标记法
1范围 本文件措述了利用单核苷酸多态性（single nucleoide polymorphism，SNP）标记进行普通烟草 （NicorianatabacumL.）品种鉴定的操作程序、数据记录与统计、判定方法。
本文件适用于烟草品种的SNP指纹数据采集及品种鉴定。
2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于 本文件。
GB/T21138烟草种子 NY/T2594植物品种鉴定DNA分子标记法总则 YC/T369植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南烤烟 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理 不同烟草品种的基因组DNA存在核甘酸序列差异，其中单个核苷酸变异引起的这种多态性差异 称之为SNP。
SNP标记具有分布密度高、检测通量高、数据整合易等特点，不同品种的SNP位点基因 可通过扩增及芯片扫描等技术进行检测，从面能够区分不同品种。
5主要试剂 5.1DNA提取试剂盒。
5.2SNP芯片试剂盒。
6主要仪器设备 6.1样品粉碎仪或研磨机。
6.2恒温孵育器或水浴锅。
6.3涡旋振荡器。
6.4微量移液器。
6.5PCR扩增仪。
6.6离心机。
6.7电泳仪。
YC/T628-2025 6.8凝胶成像仪。
6.9核酸浓度测定仪。
6.10杂交炉。
6.11SNP芯片分型仪。
7标记 SNP标记相关信息见附录A。
8操作程序 8.1样品准备 8.1.1从期草品种材料中抽取的个体的数量应满足NY/T2594的要求。
8.1.2送验样品可为种子、幼苗、叶片等个体、组织或器官。
试验样品为种子时，其质量应符合GB/T21138 中对烟草种子纯度的要求。
8.2DNA提取与检测 利用DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA。
提取与纯化的DNA落液在260nm与230nm处 的吸光度值的比值介于1.5~2.0；在260nm与280mm处的吸光度值的比值介于1.8~2.0；DNA电泳 主带明显，无明显降解和RNA残留：DNA浓度>10ng/pL。
注：能够达到相应质量要求的DNA提取方法都运用于本文件。
8.3SNP指纹数据采集 8.3.1基因组DNA变性及扩增。
取200ng样品基因组DNA变性后，分别加人SNP芯片试剂盒中 扩增反应。
8.3.2DNA片段化及沉淀。
分别加人片段化缓冲液、片段化稀释液、片段化酬，置于37C杂交炉中恒 温孵育30min进行片段化反应，随后加人终止液终止反应。
加人沉淀液，混匀后再加人异丙醇，封膜 后转人一20C冰箱，沉淀DNA。
8.3.3DNA干燥和重悬。
离心后例掉上清液，将沉淀置于37C杂交炉中20min进行干燥。
随后加人 重悬缓冲液，重悬溶解DNA。
8.3.4杂交。
分别加人杂交缓冲液、杂交液，95C变性10min后，立即置于48C的金属保温板中。
吸 取样本加人芯片加样区，置于SNP芯片分型仪中杂交24h。
8.3.5芯片扫描。
分别加人染色液和缓冲液至对应位置。
运行SNP芯片分塑仪，完成连接、染色、洗 涤和扫描工作。
进行数据分析处理，同时保存原始文件。
注：以上操作程序仅为推荐方法，其他能达到同样位点分型效果的方法也可采川。
9数据记录 根据SNP标记位点的分型效果，剔除或留用该位点的数据。
数据记录为X/X或X/Y，其中X、Y 为该位点的单核苷酸，如A、T、C、G、按此顺序排列。
无效数据记录为一/一。
一个样品的有效数据所占比例若96%.判定为“近似品 种或疑同品种”。
对于”近似品种或疑同品种”的样品，按YC/T369的规定进行田间种植进一步鉴定。
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附录A （规范性） SNP标记 SNP标记见表A.1。
参考基因组为红花大金元V1.2。
表A.1SNP标记 序号染色体位置正负链序列
ACTAATTAAAAAATAACTNAGGTGCAAAGTAAATC[T/C] SI602184TAGTGAAACATAAFAATATCTEACAACGAAATATG
TTTGAACTCTGATGGGCTCO CTAAN AACAATCA[C/T] S21232GGTGAATTTAGTGGGTAGTTA GCCTCTGT 32332ATGCACGTTTGCCTAAGACCTTGGA[/]12 S31TACTTGATGCTCAATATATTGCTTG GGA
AAGAACCATCACAATTGTGAAGTC TCC. CAT[0/1]. S415225TEGCAAATTGCGAAGCT AGT TG AA
CAT ACAA TTT AGC[0/V] S57289665D.LY GCAGICAA ATCA T
8165810GG AAG GCACCO TACC AA G/A] S6 EGI CCGAT TTCCT LVIVV ATC G
AA DV.1 AAG TAAACGCTAACT[T/C] S7 CGATAAAACATGCEAAGAGACTGG AAC AAC
ATGAAATASAGTCAANGTACCAATA TGG ATA【A[C/G] S8 ATAAAAATAATTTAGTAAAACACGAN AAG VIVV 22812TCTAGAGAAATGGTGGAGAAGTTGAC TGT S91GAGAGGCAAGGAGCACGTTTTAT TCG TAATCC 130707CAGATGGAATTAATCATAAGC TAAC" S101AGATAAATCAAGATCT ACTAC ATTCATCAAGT
TACTAANGGUAGATGGACCAG[ACCGACAAAAGAA[C/G] SII14230693CTCGACAGCAGCACCECAATTCAGAAGCGCATCAC
TGGAAATCCCTTAATTTTGATACCACTGCTCTAAG[C/A) S12115640723TGCGATAATATCAATTGGCTAGATGCCATCAAACA S1316677682TAATAGTACAAATATTAGGAATATTCACTAGAATA +TGGTACACCGCCGATATCTTGTGAGATAACGTCAA[T/G] S14119061473GTGCTTTGTCACGAGGAGGGACTTTGCGTTAGAGA 120993318+AACGTAGTCTGCTGCCTCCGTGAGAGAAAGCCCTT[C/T] S15 ATACTCCATTAGAGCAGCCACATCTCTCGCTACAG ATTTTTTAGCAAAGTTGATAGGGTAACATGTGACT[T/C] S16122439721AGCACTATCAACTTAACGTCAGAAAGATCATTTTC 4...
