中华人民共和国国家标准
GB/T 36815-2018
Detectionand identificationofDiaporthevaccinii Shear
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局.本标准主要起草人：罗加风、崔铁军、刘跃庭、张莹、黄国明、廖芳.
蓝莓果腐病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了蓝莓果腐病菌的分离培养、致病性测定及分子生物学检测方法.本标准适用于蓝莓果腐病菌寄主种苗、植株和果实中蓝莓果腐病菌的检疫鉴定.
2蓝莓果腐病菌的基本信息
中文名：蓝莓果腐病菌
学名：Diaporthe vaccinii Shear
无性学名：Phomopsis zuccinii Shear N.E. Stevens &. H.F. Bain
英文名 :fruit rot of blueberry Phomopsis canker of blueberry upright dieback of cranberry
分类地位：蓝莓果腐病菌（Dia porthe tuaccini Shear）属真菌界（Fungi），子囊菌门（Asycota），子囊菌纲（Asycetes），间座壳目（Diaporthales），间座壳科（Diapouthaceae），间座壳属（Dia porthe）.
传播途径：病菌依靠带菌种苗和果实进行远距离传播.
蓝莓果腐病菌的其他信息参见附录A.
3方法原理
ITS4核酸序列比对结果作为蓝莓果腐病菌的检疫鉴定依据. 病原菌的为害症状、分离培养性状、形态特征、致病性测定（参见附录A、附录B、附录C）及1TS1/
4仪器用具和主要试剂
4.1仪器用具
4.1.1仪器
体视显微镜、生物显微镜、超净工作台、生物培养箱、电子天平、高压灭菌锅、常规冰箱（一20C），PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅.
4.1.2用具
灭菌培养Ⅲ（直径90mm～100mm）、三角瓶、镊子、手术剪、手术刀、接种针、一次性注射器（1mL）、棉纱、脱脂棉、酒精灯、塑料研样、可调微量加样器.
4.2主要试剂
乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基磺酸钠（SDS）、Tris-HC1、氯仿、异戊醇、三氯甲烷、乙醇、氯化钾、氯化镁、蛋白酶K、引物ITS1/ITS4、Tag聚合酶等分子生物学试剂，或用植物组织及真菌基因组提取试剂盒提取DNA.葡萄糖、琼脂、青霉素、链霉素、乳酸、2.0%次氯酸钠（NaCIO）.
酸性马铃薯葡萄糖培养基（APDA，pH5.0~6.0）APDA选择性培养基（制备方法参见附录D）.
5病菌的鉴定
5.1症状检查
取待检植株，观察植株枝条是否有萎，树皮下是否有溃疡病斑，芽周围的树皮是否变褐色，叶片上是否有病斑，果实是否有腐烂，枝、叶、果实上是否有病菌的子实体（分生孢子器或子囊壳，参见附录A中图A.1）.发现子实体的，直接进行镜检：发现有可疑症状但未发现子实体的，取可疑的枝、叶、果实一 部分进行保湿培养，诱发分生孢子器产生，一部分进行分离培养.
5.2直接镜检
的形态特征同时将孢子转接到APDA选择性培养基上进行分离培养. 发现病菌子实体的，直接用灭菌的挑针或牙签挑取，制片镜检，显微镜下观察分生孢子器、分生孢子
5.3保湿培养
可疑枝条病健交界部分，用手术刀切成5cm～7cm长的片段，叶片取整片叶片或切取部分叶片，度，在体式显微镜下观察是否有分生孢子器等产孢结构形成.分生孢子产生后及时转接到APDA选择 果实取整个果实，灭菌水冲洗后进行保湿培养，21C～24C，12h/12h光照黑暗交替培养，注意保持湿性培养基上进行分离培养.
5.4病原菌的分离培养
2cm长的片段，自来水冲洗后，2.0%次氯酸钠表面消毒1min，再用灭菌水冲洗3次，置APDA选择性 未发现病菌子实体的样品进行组织培养，将有可疑症状的枝、叶、果实病健交界处组织剪成1cm~培养基平板上，20℃～24℃培养，培养3d开始观察菌落形态，发现乳白色或白色可疑菌落，立即用APDA纯化，黑暗培养，7d后体视显微镜下观测分生孢子器产生情况，显微镜下测定分生孢子器、分生孢子形态特征.
5.5致病性测定
如有必要，进行致病性测定.
泥炭和沙子按照1：1的比例混匀后，种植蓝莓苗，当蓝莓花芽长出时，用蓝莓果腐病菌孢子悬浮液20℃～28C黑暗条件下保湿培养3d然后移至温室继续培养. （孢子适宜浓度为1×10CFU/mL）对蓝莓花芽进行喷雾接种，以蒸馏水为对照，接种后放人培养箱内
接种后观察植株发病情况，如出现可疑病斑，取病健交界处组织2.0%次氯酸钠溶液消毒1min，无菌水清洗3次，置APDA选择性培养基上培养并进行病菌再分离.
5.6核酸序列比对
5.6.1引物
采用ITS1/1TS4进行扩增，目标片段约为590bp. ITS1;5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'ITS4;5'TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'
5.6.2DNA提取
2 可疑菌株在APDA上生长7d左右，取菌丝提取DNA（参见附录E），也可用植物组织及真菌基因
组提取试剂盒提取DNA，提取步骤详见使用说明.
5.6.3PCR反应
PCR反应体系总体积30pL，包含：缓冲液3.0μL;10mmol/L dNTP 0.5pL:Tag聚合酶2.5U；引物各0.5μL(20μmol/L);DNA模板1μL.反应程序;94C预变性 2min;94℃C 1 min，53“C 1 min 72C延伸1.5min，30个循环：72C延伸10min.
扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶1XTAE缓冲液中电泳，EB染色后凝胶成像，如有目标片段大小的单带出现，扩增产物进行序列测定.
将测序获得的序列与NCBl网站GenBank中相关序列进行同源性比对分析.
6鉴定特征
6.1培养性状
APDA培养基上菌落平铺不隆起乳白色也有的菌落为黄灰色或灰福色，产生3个～5个界限明显的环痕（个别菌株不产生环痕），菌落老熟后环痕不明显，菌丝毡状或羊毛状，菌落生长较快，速度为10mm/d~12mm/d；培养7d后菌落中出现黑色的分生孢子子座，皮革状，0.8mm~2.8mm，内生分 生孢子器，参见附录B中图B.1.
6.2形态特征
散生或合生，单腔，单孔口，寄主上的分生孢子器较培养基上的小，大小为0.2mm×0.5mm，培养基上 无性态形态特征：分生孢子器黑色，部分埋生于寄主组织或培养基质内，球形至不规则形，基部宽，大小为（0.5mm~1.0mm）×（1.2mm~1.3mm），分生孢子器常不规则破裂，释放白色、淡黄色或粉红色成团的分生孢子黏液.分生孢子两种形状a型和β型：α孢子无色，单胞，透明，椭圆形，具2个明显的油球，大小（6μm~10 5μm）×（2.2μm~3.2μm），平均7.8μm×2.9μm：β孢子线形，钩状，单胞无色，大小（15μm~24μm）×（1μm~1.5μm），平均20μm×1.2pm，参见附录B中图B.2.分生孢子黏 液中a型孢子丰富，β型孢子则较少.
有性态形态特征：有性阶段子囊壳需经过越冬阶段在2年～3年枯死枝条上产生，子囊壳通常在树皮和木质部之间生成，有时靠近分生孢子器.成熟的子囊壳具长颈突出树皮外，子囊壳直径（0.3mm～0.5mm）×（0.2rmm~0.4mm），球形，黑色，壁厚多层，基部较平；子囊椭网形，无柄，（37μm~51μm）×（7μm~12μm），孔口小，顶部增厚，含8个子囊孢子；子囊孢子椭圆形，有时不规则形，大小（8μm~ 12μm）×（2μm~3μm），双胞，隔膜处稍缩，各具1个油球.培养基上较难产生子囊壳，培养时间长，子囊和子囊孢子较寄主上小，子囊大小为（32pm~48pμm）×（5.8μm~9.6μm），子囊孢子为(6.4 μm~12.8 μm) × (2.5 μn~4.2 μm) .
蓝莓果腐病菌与蓝莓上其他近似种的区别参见附录F.
6.3致病性测定的症状表现
接种后的幼苗在温室生长3d后，接种的花出现坏死，随着花盛开，坏死的情况进一步扩展.接种后1周，与花芽毗邻的茎出现坏死，在接种2周～3周后病斑继续扩展，茎上坏死溃疡病斑发展成深褐色（参见附录C中图C.1）.
发病植株茎部病健交界处组织消毒后分离培养，7d后长出6.1及6.2所述典型菌落和分生孢子器，可证明分离菌是蓝莓果腐病菌的病原菌.
