中华人民共和国国家标准
GB/T34223-2017
核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度 检测方法
Determination of the purity of ribonuclease and desoxyribonuclease
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由中国标准化研究院提出并归口.
工商大学、河北农业大学、合肥工业大学、河北省出人境检验检疫局、泉州市标准化研究所、北京市食品 本标准起草单位：中国标准化研究院、厦门市格灵生物技术有限公司、中国生物技术发展中心、浙江科学研究院、河北食品检验研究院、东营市标准化信息所、河南大学
本标准主要起草人：马爱进、陈智勇、苏月、王彦波、孙纪录、郑磊、刘道亮、林清山、孙勇、云振宇、傅玲琳、吴琦、赵琳、周魏、刘鹏、康文艺、宗学花.
核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度 检测方法
1范围
本标准规定了核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测原理、仪器设备及器具、主要试剂、分析步骤和结果分析.
本标准适用于生化试剂核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶产品的生产和检测.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
SN/T3926出口乳、蛋、豆类食品中蛋白质含量的测定考马斯亮蓝法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
核糖核酸酶ribonuclease：RNase
水解核糖核酸（RNA）中磷酸二酯键，生成寡核苷酸或单核苷酸的核酸酶.
水解脱氧核糖核酸（DNA）中磷酸二酯键，生成寡核苷酸或单核苷酸的核酸酶.
4原理
一定浓度的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）可分离分子质量不同的蛋白质，经考马斯亮蓝（CBB）染色脱色成像后通过计算进行核酸酶的纯度检测，
5仪器设备及器具
5.1电泳系统.5.2凝胶扫描装置.5.4电子天平：精度为0.0001g、0.01g和0.1g. 5.3水平脱色摇床，转速45r/min.
6主要试剂
本方法所用试剂均为分析纯，实验用水均为GB/T6882规定的二级水.
6.130%亚甲基双丙烯酰胺溶液（Acr-Bis）
取丙烯酰胺29.0g，N，N'-甲叉双丙烯酰胺1.0g，加人60mL水，充分搅拌溶解，定容到100mL.用0.45μm微孔滤膜过滤除菌和杂质后储于棕色瓶，4C避光保存.如有沉淀应过滤，两个月后溶液应重新配制备用.
6.21.0mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液（Tris-HCl）.pH6.8
取12.12g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶于80mL的水中，充分搅拌溶解，用HC1调pH值为6.8，定容至100mL，室温保存备用.
88（-）由由
取18.17g三羟甲基氨基甲烷溶于80mL的水中，充分搅拌溶解，用HC1调pH值为8.8，定容至100mL，室温保存备用.
6.410%十二烷基磺酸钠（SDS）溶液
取10.0g十二烷基磺酸钠充分溶于约80mL的水中，定容至100mL，室湿保存备用.
6.510%过硫酸铵（APS）溶液
取0.1g过硫酸铵于1.5mL离心管，加1mL水溶解，现配现用.
6.610倍Tris-甘氨酸电极缓冲液
取30gTris、144g甘氨酸、10gSDS溶于800mL水中，定容至1L，室温保存，使用时稀释10倍.
6.75倍十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）加样缓冲液
取1.25 mL 1.0 mol/L Tri-HCl(pH 6.8)、SDS 0.50 g、2.5 mL 甘油0.025 g澳酚蓝，用水落解定容解，现配现用. 至5mL，按照每管500μL分装后，4C保存备用.临用前每管加0.078g二硫苏糖醇（DTT)，充分溶
6.8染色液
染色液A：考马斯亮蓝G-2500.1g、95%乙醇50mL.85%磷酸100mL 用水定容至1000mL、保存备用.
染色液B：考马斯亮蓝R-2500.5g、冰乙酸25mL、乙醇250mL，用水定容至500mL，室温保存.
6.9脱色液
取100mL冰乙酸、400mL甲醇，用水定容至1L，室温保存.
6.10标准蛋白质
分子质量为6.5kDa~66.4kDa或分子质量为6 5 kDa~200kDa.
6.111.0mg/ml牛血清白蛋白标准溶液
取0.01g纯度≥98%的牛血清白蛋白，精确至0.0001g，溶于10mL浓度为0.15mol/L的NaCl溶液中.
7分析步骤
7.1蛋白质含量测定
按照SN/T3926进行测定.
7.2纯度测定
7.2.1电泳样品制备
称取0.025g待测样品，精确至0.0001g溶解于10mL水中，浓度为2.5mg/mL.其中核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶样品分别稀释为浓度0.625mg/mL、1.25mg/mL，现配现用，并将稀释后的待测样品20pL与5倍电泳加样缓冲液5pL在一个离心管中混合，100C水浴加热10min后，冷却备用.
7.2.2电泳装板
将电泳所使用的玻璃板洗净、晾干，短板向外，长板向内嵌人塑料架中，并固定.
7.2.3电泳分离胶和浓缩胶的配制
组装制胶装置，按表1分别配制4%浓缩胶和12%分离胶溶液.
表1浓缩胶、分离胶配方
溶液成分 4%浓缩胶/mL 12%分离胶/mL30 % Acr-Bis 0 65 3 971 5 mol/1. Tris-HCl(pH 8 8) 0 2.51.0 rmol/1 Tris-HC1(pH 6 8) 0 63 0.10%APS 0 05 0 110% SDS 0 05 1四甲基乙二胺（TEMED) 水 0 005 3.7 0 005 3.4
7.2.4电泳上样
核糖核酸酶选择分子质量为6.5kDa~66.4kDa的标准蛋白、脱氧核糖核酸酶选择分子质量为6.5kDa~200kDa的标准蛋白，上样量均为10μL，每个样品设3个重复.
7.2.5电泳
电泳按照每块胶加70V电压，待样品中的溴酚蓝指示剂超过浓缩胶与分离胶分界线时，加大电压至 在配置好的电泳装置系统中加人电极缓冲液，浸没电极，采用微量加样器分别吸取待测样品初始110V继续电泳，当澳酚蓝指示剂前沿到达电泳槽底部时停止电泳.
7.2.6电泳染色与脱色
电泳结束后将凝胶移至染色盒中，加人染色液B，置于水平摇床染色至条带清晰，随后倒出染色液B.加入脱色液，置于水平摇床上脱色至凝胶底色脱尽且蛋白条带清晰可辨，期间可更换脱色液.
