中华人民共和国国家标准
GB/T 34794-2017
Guidelines for DNA gel purification kit
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口.
本标准起草单位：中国测试技术研究院生物研究所、中国测试技术研究院、凯杰企业管理（上海）有限公司、四川中测生物科技有限公司.
本标准主要起草人：周李华、史谢飞、马丽侠、唐小波、侯晓妮、王智、李怀平、叶德萍、孙登峰、谭和平.
琼脂糖凝胶回收试剂盒测定通则
1范围
本标准规定了柱式琼脂糖凝胶回收试剂盒的DNA回收产物评估指标及测试方法.本标准适用于柱式琼脂糖凝胶回收试剂盒的测定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 11165实验室pH计GB/T26813双光束紫外可见分光光度计JJG646移液器检定规程YY/T0087电泳装置YY/T0657医用离心机
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件，
3.1
DNA 纯化DNA purification
采用适当方法降低可以观察到的或可测量到的连接、酶切、标记、扩增等抑制物的过程，为获得更高纯度DNA
DNA回收率DNA recovery rate
即DNA回收得率，DNA目的片段回收后与回收前的产量百分比.
3.3最大上样量column reservoir capacity
单个吸附柱的单次最大上样体积.
3.4
吸附柱的承载量bindingcapacity
单个吸附柱每次最多可吸附DNA的量.其决定了单次回收的DNA最大量.
4原理
心柱上作为吸附剂，在高盐（如3 0mol/1~5.0mol/L盐酸胍>低pH（5.0mol/L~6.5mol/L）状态下， 介质吸附法是一种常用的纯化核酸的方法.柱式回收试剂盒是将硅胶膜或其他吸附介质固定在离
GB/T 34794-2017
吸附柱专一性地吸附DNA:而在低盐（TE或者2.5mmol/LTris-HCI）或水溶液状态下，DNA被洗脱下来.
5仪器和设备
5.2水浴锅或金属浴：温度范围60℃~70℃. 5.1离心机：转速10000r/min以上，应符合YY/T0657的要求.5.3电泳系统，应符合YY/T0087的要求.5.4凝胶成像系统.5.5 可调移液器：0.5 μL~10 μL、10 μL~100μL、100μL~1 000μL、0.5 mL~5 mL，应符合 JJG 646的要求.5.6紫外分光光度计，应符合GB/T26813的要求. 5.7pH计，应符合GB/T11165的要求.5.8天平：精度为0.1mg.5.9刀片，
6试剂
除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂，水为GB/T6682规定的一级水.试剂溶液（含水
溶液）宜大体积配制、小体积分装经高压灭菌后使用，不宜高压灭菌的试剂应用0.22μm膜过滤除菌；酶溶液应避免反复冻融.6.1三羟甲基氨基甲烷（Tris）.6.2盐酸(Hydrochloric acid，HCl). 6.3氢氧化钠（Sodium hydroxide，NaOH).6.4乙酸钠（sodium acetate，NaAc）溶液：3mol/L，用乙酸调pH至5.2，0.22ym膜过滤.6.5乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt Na EDTA CHNO Na).6.7琼脂糖（Agarose，AG）. 6.6无水乙醇（alcohol.CH;OH），4C保存及使用.6.8核酸染剂（如 Gold View等染料）.6.9上样级冲液（Loading buffer).6.10DNA 标准品（HindIl酶切的aDNA产物）.6.11100倍电泳缓冲液溶液（TAE):4mol/LTris-HCl（pH8.0)，2mol/L醋酸钠 200mmol/LEDTA.使用时稀释100倍.6.12TE缓冲液（pH 8.0）:10mmol/LTris-CI 1 mmol/1EDTA，使用HCl或NaOH调节 pH，4℃ 保存备用.
7试验方法
7.1标准DNA溶液的配制
液备用. 将不同的DNA Fragment（10 bp~20 000 bp）用 TE缓冲液分别配制成1 μg/μL的DNA 标准溶
7.1.1DNA Fragment 1（片段范围为 10 bp~100 bp 不含 100 bp）：20 bp（记为 DNA 1)50 bp（记为DNA2）、80bp（记为DNA3）或取均匀分布在范围内的任意其他3个不同大小的DNA片段.
7.1.2DNA Fragment 2(片段范围为 100 bp~1 000 bp，不含 1 000 bp）：100 bp（记为 DNA 4）、500 bp（记为DNA5）、800bp（记为DNA6）或取均匀分布在范围内的任意其他3个不同大小的DNA片段.
000002 000 bp(记为 DNA 8）、5 000 bp(记为 DNA9）、8000 bp（记为DNA 10)或取均匀分布在范围内的任 意其他4个不同大小的DNA片段.
7.1.4DNA Fragment 4(长度范围为 10 000 bp~20 000 bp 不含 20 000 bp):10 000 bp(记为 DNA11)、15 000bp（记为DNA 12)、20 000 bp（记为 DNA13)或取均匀分布在范围内的任意其他3个不同大小的DNA片段.
7.2吸附柱的最大上样量
用移液枪向吸附柱中加人蒸馏水至刻度，记录加入的蒸馏水体积即为吸附柱的最大上样量.
7.3吸附柱的承载量
将800bp（或按照待测试剂盒说明中可回收片段的任意片段）DNAFragment溶液按照表1体系混合DNA溶液与胶回收试剂盒的溶胶液后加人吸附柱.
表1吸附柱的承载量
试验项目 DNA溶液/sL 落胶液/L DNA上样量/μk试验 I 5 95 5试验Ⅱ 10 90 10试验 II 15 85 15试验IV 20 80 20试验V 30 70 30
按照待检测的试剂说明书进行后续清洗、洗脱步骤收集回收液，采用紫外分光光度计法，测定回收的DNA溶液在260nm处的吸收值，利用A=1相当于50μg/mL的DNA来计算回收DNA的浓度，乘以回收液体积可得回收的DNA总量，以DNA上样量为横坐标绘制回收量曲线图，曲线上限即为吸附柱的承载量.
7.4DNA回收产物的质量测定
7.4.1纯度的测定
纯度按照以下步骤进行测定：
a）根据试剂盒说明书，选取待测试剂盒可回收片段范围内的任意3个不同大小的DNA标准落液进行琼脂糖凝胶电泳（上样时确保避免损坏凝胶和样品无溢出）.电泳完成后在紫外凝胶成
和试剂用量按照待测的胶回收试剂盒说明书进行.b）采用紫外分光光度计法将试剂盒回收得到的DNA溶液进行适当稀释，使样品溶液在260nm处的吸收值在0.1~0.5之间，以稀释液做参比，测定样品溶液在260nm、280nm、230nm处
