中华人民共和国国家标准
GB/T 36191-2018
Protocol of diagnostic methods for red sea bream iridovirus disease(RSIVD)
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.本标准由中华人民共和国农业农村部提出.本标准起草单位：深圳出入境检验检疫局、中山大学、深圳市检验检疫科学研究院. 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156）归口.本标准主要起草人：兰文升、刘莹、于力、王津津、史秀杰、董传福、刘、贾鹏、郑晓聪、何俊强、叶奕优、王红英.
真鲷虹彩病毒病诊断规程
1范围
本标准规定了真鲷虹彩病毒病（Red sea bream iridovirus disease，RSIVD）临床诊断、采样和病毒分离鉴定和综合判定的方法.
本标准适用于水生动物真鲷虹彩病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB/T18088出人境动物检疫采样SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范
3缩略语
下列缩略语适用于本文件.BLAST;局部序列比对检索工具(basic local alignment search tool)bp:碱基对(base pair) CTAB：十六烷基三甲基澳化铵（cetyltrimethylammonium bromide）CPE：细胞病变效应（cytopathiceffect）DMEM: Dulbeco Eagle *s minimum essential mediumFITC：异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate） EB:澳化乙锭(ethidium bromide)IFAT：间接荧光抗体实验（indirect fluorescent antibody test）ISKNV：传染性脾肾坏死病毒（infectious spleen and kidney necrosis virus)MFF-1:繁鱼鱼苗细胞系（mandarin fish fry cell line)PBST:含 0.05 %吐温-20的 pH7.4 的磷酸盐缓冲液(0 05 % tween phosphate buffered saline) PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline)PCR：聚合酶链式反应（polymerase chainreaction）RSIV：真鲷虹彩病毒（red sea bream iridoviral virus)RSIVD：真網虹彩病毒病（red sea bream iridoviral disease)
4试剂和材料
4.2RSIV参考株.注：由农业部相关部门指定提供.
4.1水：符合GB/T6682中一级水的规格.
GB/T 36191-2018
4.3PCR反应试剂（dNTPs，Taq酶等），保存-20℃.4.4引物：引物浓度为20umol/L.引物序列：1-F;5'-CTC AAA CAC TCT GGC TCA TC-3′;4.5MFF-1细胞系. 1-R;5'-GCA CCA ACA CAT CTC CTA TC-3′;注：由农业部相关部门指定提供.4.6细胞培养液：含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液.4.7胎牛血清（FBS）.4.8抗RSIV的单克隆抗体（鼠源）. 注：由农业部相关部门指定提供.4.9异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗小鼠抗体.
5器材和设备
器材和设备包括如下：
a）超净工作台.b）冷冻离心机. c）生化培养箱.d）普通冰箱和低温冰箱.e）荧光显微镜.f）倒置显微镜.g）PCR仪.h）核酸电泳系统. i）凝胶成像仪.
6临床诊断
6.1临床症状
该病主要症状为鱼体色变黑，游动缓慢，呼吸加快，外表症状不明显，个别眼球突出、出血，体表出血.内脏诸器官褪色，脾脏肿大.
6.2组织病理检测
大的细胞. 制备脾脏的印片或组织切片，经吉姆萨（Giemsa）染色，见附录A中A.1，患病样品镜检可见异常肿
6.3结果判定
6.3.1符合6.1的临床症状典型特征，并且经组织病理检测可见异常肿大的细胞，临床诊断结果阳性.6.3.2不符合6.1的临床症状典型特征并且经组织病理检测未见异常肿大的细胞，临床诊断结果 阴性.
7采样
7.1采样对象
牙鲜、美国红鱼、真鲷、鱼和繁鱼等易感鱼类.
7.2采样数量
采样数量应符合SC/T7103的要求.
7.3样品采集
于6cm的鱼则取脾、肾、心脏、肠和鲲. 按GB/T18088的规定执行，且体长≤4cm的鱼苗取整条，体长4cm~6cm的鱼取内脏；体长大
8病毒分离和签定
8.1病毒分离
8.1.1样品处理
每5尾鱼为1个样品，若有症状成鱼每1尾为1个样品，采集的组织样品（最少不低于5g）立刻研磨匀浆，用细胞培养液将研磨后的组织稀释10倍，置于25℃~27C培养箱中孵育24h，待用.
8.1.2病毒分离培养
8.1.2.1将MFF-1细胞经细胞消化液（见A.2）消化后加细胞培养液转接至96孔板，培养24h，制备8.1.2.2将孵育的组织样品8000g离心15min，收集组织匀浆上清液. 单层细胞，待用.8.1.2.3组织匀浆上清液做10倍稀释，在无菌条件下，分别接种到MFF-1细胞的96孔板，每孔中加人的组织上清液的量与细胞培养液的比例为1：10.同时设立阳性对照（接种RSIV参考株）和阴性对照（未接种病毒的细胞），置于25C~27C培养.
8.1.3细胞病变效应的观察
8.1.3.1倒置显微镜下观察细胞变化.8.1.3.2被检样品接种7d后没有观察到CPE（阳性对照已出现CPE），需盲传一次.传代程序：将接种细胞反复冻融，收集细胞培养液，8000g离心15min，上清液分别接种到新制96孔板的单层细胞中，继8.1.3.3如果细胞培养板的孔中出现CPE，细胞培养液进行IFAT试验或PCR鉴定. 续培养7d并观察.
8.1.4结果判定
8.1.4.1以感染RSIV参考株的细胞培养物为阳性对照，以未感染RSIV的细胞为阴性对照.如果阳8.1.4.2如果病毒分离培养中出现CPE，则判定病毒分离结果阳性. 性对照出现CPE，阴性对照无CPE，则实验成立，否则，重新实验.8.1.4.3如果病毒分离培养和盲传培养没有出现CPE，则判定病毒分离结果阴性.
