中华人民共和国国家标准
GB/T 35329-2017
Detection andidentification ofPhytophthora medicaginisE.M.Hans.et D.P.Maxwell
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院. 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.本标准主要起草人：张格君、杜洪忠、郭京泽、贺艳、刘鹏、刘跃庭、吴品珊.
首疫霉根腐病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了首着疫霉根腐病菌的检疫鉴定方法.
的首着疫霉根腐病菌的检疫和鉴定. 本标准适用于针对首着疫霉根腐病菌寄主（参见附录A）的植物、植物产品以及夹带土壤和介质中
2首着疫霉根腐病菌基本信息
学名 :Ph ytophithora wedicaginis E.M. Hans. et D.P. Maxwell.
分类地位：藻菌界（Chromista），卵菌门（Oomycota），霜霉纲（Peronosporea），霜霉目（Peronosporales），霜霉科（Peronosporaceae），疫霉属（Ph ytophrhora）.
传播途径：土壤，流水，栽培介质，幼苗根部组织均能带菌、传播，贸易调运的干首着草也有远距离传播的风险.
首疫霉根腐病菌的其他信息参见附录A.
3方法原理
寄主植物发病症状、病原菌的形态学特征和病原菌基因组目标片段的序列特征为鉴定依据样品采集.
4仪器和用具
4.1仪器
超净工作台，光照珞养箱，人工气候箱生物显微镜，电子天平（感量0.01g），高压灭菌锅，血球计数扩增仪. 器，恒温水溶锅，高速冷冻离心机，制冰机，分光光度计，PCR扩增仪，电泳仪，凝胶成像系统，荧光PCR
4.2用具
烧杯，三角瓶，量筒，培养Ⅲ，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，接种针，载玻片，盖玻片，塑料研，移液器，移液器吸头，离心管.
5试剂和培养基
5.1试剂材料
除另有规定外，试剂均为分析纯.匹马霉素（CH：NO），氨苄青霉素钠盐（CHNOSNa），利福平钠盐（CHN O），五氯硝基苯（CCNO），碳酸钙（CaCO），次氯酸钠（Na(OC1）.
三羟甲基氨基甲烷（CHNO），氯化钠（NaCl），盐酸（HCI），乙二胺四乙酸四二钠（CHNONa），
GB/T 35329-2017
氯氧化钠（NaOH），十六烷基三甲基溴化铵（CHBrN）.电泳缓冲液（1×TAE），无水乙醇（CH;OH），异丙醇[CHCH（OH)CH，]，三氯甲烷（CHCI），异戊醇（C;HO），琼脂糖，PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶，脱氧核苷三磷酸（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）.100 bp DNA分子量Marker，PCR引物 PrF 和 PmR 实时荧光PCR引物 P990-F P1050-R 和探针 P1010-Pr.
琼脂粉，V8汁.
5.2培养基
拌混匀，定容至1000mL，121℃，灭菌30min，制备培养基平板备用. V8培养基：100mL过滤后的V8液，加人2.5gCaCO （碳酸钙），17g琼脂粉，蒸馏水800mL，搅
选择性培养基PARP-V8:50mL过滤后的V8液，17g琼脂粉，800mL蒸馏水，定容至1000mL，121℃，灭菌30min，冷却到50℃，加人50%的匹马霉素0.01g，氨苄青霉素钠盐0.25g，利福平钠盐0.01g，五氯硝基苯0.05g搅拌混匀，制备培养基平板备用.
6实验室检验
6.1症状检查
或介质，一并收集：对于干首着草等植物产品挑选色泽异常的，具体症状参见附录A. 对于植株样品，重点观察根部有无变色、病斑，植株有无枝条枯菱、顶梢死亡等：如植物携带有土壤
6.2分离培养和诱集
6.2.1组织分离培养
新鲜植物根、茎组织在流水下冲洗1h~2h.在病健交界处或变色部位切取边长为5mm~10mm3次，灭菌滤纸吸干水分，放于V8或选择性培养基PARP-V8上. 的组织块，用75%乙醇浸润5s，接着用1.25%的次氯酸钠表面消毒3min~4min，然后灭菌水冲洗
干首着草用无菌水喷酒，在无菌培养Ⅲ中保湿8h~12h，无菌水冲洗3次，灭菌滤纸吸干水分，放于V8或选择性培养基上.
培养Ⅲ25C黑暗培养4d~6d后，组织周围培养基上长出稀疏菌落，挑取菌落边缘菌丝块转人V8培养基纯化，25黑暗培养.
6.2.2土壤和介质诱集
4.0cm左右，然后加人10片左右直径8mm～10mm的健康首着种子长出的子叶或未成熟萃果的小切 称量土块或介质25g，碾碎放人500mL灭菌洁净烧杯中.每份样品加灭菌蒸馏水，水面距土表片，切片大小以漂浮在水面为宜，封口膜封口保湿，25℃黑暗条件下放置3d～5d.
6.2.3诱集检查和培养
诱集3d～5d后，观察首着叶片或苹果切片附近是否有棕色病变区，从变色的病健交界处取5mmX5mm小块，75%乙醇消毒30s，置V8培养基或选择性培养基PARP-V8.25C黑暗培养.
25℃黑暗培养. 培养4d～6d后，组织周围培养基上长出稀疏菌落，挑取菌落边缘菌丝块转人V8培养基纯化，
7PCR检测
7.1DNA提取
刮取菌落上的菌丝体（100mg），放入1.5mL离心管中，浸在液氮里预冷，用塑料碾碎待用.
离心管加人700pLCTAB缓冲液（见附录B）混匀，65C水浴30min，期间颠倒混匀离心管2次~10min，保留上清液；加人0.6倍上清液体积的异丙醇混匀，-70C下放置30min，或一20℃放置1h；13000g离心10min.可见DNA沉淀：加人1mL经4C预冷70%乙醇洗DNA沉淀，13000g离心 10min，小心倒去上清液，重复上述4C预冷70%乙醇洗涤DNA步骤一次，室温或真空干燥系统中挥干液体；用30L~50μLTris-EDTA缓冲液溶解DNA，待用.
根据自身情况也可采用商品化的试剂盒提取菌丝体DNA.
7.2DNA浓度测定和定量
样品DNA用紫外分光光度计测定260nm和280nm处吸收值，分别计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：
DNA的纯度比值应在1.7~1.9之间，浓度定于25ng/μl
7.3普通PCR检测
首蓄疫霉根腐病菌的特异性引物PmF和PmR序列分别为5'-AAACCTATCAGCGAAGGC-3，5'-ATATTGGACATAACGAGCCT-3'，预期扩增片段大小214bp.
2.5 mmol/ L dNTP 1 μL5 μmol/L I物各 1 μL，5 U/μL Taq DNA 聚合酶 0.3 μLddH;O 16.2 μL.
扩增体系:25 μL:样品 DNA 1 μL(25 ng DNA) 10× PCR 缓冲液 2.5 μL 25 mmol/L MgCI 2 μL
反应条件：94C预变性3min，然后进人循环：95℃变性20s 53C退火30s 72C延钟1min：共35个循环，最后72C延伸10min.
凝胶成像仪分析结果. 在1×TAE电泳缓冲液中，1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压2V/cm~5V/cm，0.5%EB染色15min，
每个PCR反应设置2个重复，在试样进行PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照.以其他种疫霉为阴性对照，以首着疫霉根腐病菌基因组DNA为阳性对照，以去离子水为空白对照.各对照PCR反应体系中，除模板外，其余组分及PCR反应条件相同.
7.4实时荧光PCR检测
实时荧光PCR引物序列为P990-F：5′-GGTGGGTGGAACGAAGGA-3和P1050-R：5'-TG-GCAGCGGAGATCCAA-3' P1010-Pr: 5'-(FAM) CCGCGCCAGTATTTGTCTTCCGG (BHQ1)-3' 探针5'端标记的荧光报告基团为FAM，3'端标记的荧光猝灭基团为BHQ1.
反应体系（25μL):样品 DNA 1μL(25ngDNA)，10× PCR缓冲液 2.5μL 25mmol/LMgCl;2 μL 2.5 mmol/L dNTPs 2 μL 10 μmol/L 引I物(P990-F P1050-R)各 1 μL 10 μmol/L 探针 P1010-Pr 1.5 μL 5 U/pμL Tαq DNA 聚合酶 0.3 μL，ddH;O 13.7 μL.
反应循环为：94℃C10min→94C15s、56℃60s循环40次.
每个PCR反应设置2个重复，在试样进行PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照.以其他种疫霉为阴性对照，以首着疫霉根腐病菌基因组DNA为阳性对照，以去离子水为空白对 照，各对照PCR反应体系中，除模板外，其余组分及PCR反应条件相同.
8鉴定特征
8.1形悉学特征
菌落密集，白色，边缘平滑，25C时.生长速度大约每天4mm~5mm
