中华人民共和国国家标准
GB/T 36810-2018
Detection and identification of Fusarium oxysporum (Schlecht.）f. sp.FragariaeWinks&Williams
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局.本标准主要起草人：刘跃庭、罗加风、牛春敬、崔铁军、廖芳.
草莓枯萎病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了草莓枯萎病菌的检疫鉴定方法.本标准适用于草莓苗中及其携带土壤中草莓枯萎病菌的检疫鉴定.
2草莓枯萎病菌的基本信息
中文名：草莓枯菱病菌
学名 :Fusariu o.xysporum (Schlecht.) f. sp . fragariae Winks &. Williams
英文名：fusarium wilt of strawberry
分类地位：草莓枯萎病菌属真菌界（Fungi），子囊菌门（Asycota），盘菌亚门（Pezizomycotina），粪壳菌纲（Sordariomycetes），肉座菌目（Hypocreales），丛赤壳科（Nectriaceae），镰刀菌属（Fusariam）.
传播途径：病菌依靠带菌种苗和土壤进行远距离传播.
草莓枯萎病菌的其他信息参见附录A.
3方法原理
定依据.
4仪器用具和主要试剂
4.1仪器用具
显微镜、超净工作台、生物培养箱、电子天平、高压灭菌锅、常规冰箱（一20C）.PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅.
培养皿、三角瓶、镊子、手术剪、手术刀、接种针、移液器、酒精灯.
4.2主要试剂
乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基磺酸钠（SDS）、Tris-HC1、异戊醇、三氯甲烷、无水乙醇、70%乙醇、氯化钾、氯化镁、蛋白酶K、引物FofraF/FofraR、Taq聚合酶等分子生物学试剂.或用植物组织及 真菌基因组提取试剂盒提取DNA.蔗糖、葡萄糖、琼脂、青霉素、链霉素、0.5%次氯酸钠（NaCIO）.
马铃薯蔗糖培养基（PSA）、马铃薯葡萄糖培养基（PDA）的制备参见附录B
5病菌的鉴定
5.1症状检查
取待检植株，观察植株有无生长不良、矮小衰弱及腐烂症状，下部叶片是否变紫红色萎，心叶是否
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变黄绿或黄色，纵切叶柄、果梗和根部，检查维管束是否变色（参见附录A中图A.1），对变色的可疑材料进行分离培养.检查植株有无附着土壤，若发现土壤，对土壤进行分离培养.
5.2病原菌的分离培养
5.2.1种苗中病原菌的分离培养
变色的可疑材料用0.5%次氯酸钠表面消毒5min，再用灭菌水冲洗30min，剪成约3mm~5mm孢子及厚垣孢子着生情况和形态特征. 小段置PSA或PDA平板上25℃，全光照下培养，培养48h后开始观察菌落形态、大分生孢子、小分生
5.2.2土壤中病原菌的分离培养
0.5mL土壤稀释液涂抹于PSA或PDA平板上，每处理涂抹5个培养Ⅲ，25C，全光照下培养，培养 取2g土壤放人200mL灭菌水中，用磁力棒搅拌30min，使其充分混匀，悬浮液稀释10倍，取48h后开始观察菌落形态、大分生孢子、小分生孢子及厚垣孢子着生情况和形态特征.
5.3分子生物学鉴定
5.3.1引物
采用特异性引物FofraF/FofraR进行扩增，目标片段为239bp.FofraF:5'-CAGACTGGGGTGCTTAAAGTT-3 FofraR:5'-AACCGCTAGGGTCGTAACAAA-3
5.3.2DNA提取
基因组提取试剂盒提取DNA，提取步骤详见使用说明. 可疑菌株在PSA或PDA上生长7d左右，取菌丝提取DNA（参见附录C)，也可用植物组织及真菌
5.3.3PCR反应
PCR反应体系总体积25pL，包含：EmeraldAmp Max PCRMaster Mix（2× Premix）（CodeRR320）12.5μL;ddHO9.0pL;引物各1.0μL;DNA模板1.5μL（30ng/μL).PCR反应程序：94℃ 预变性2min；94C变性1min，63C复性1min.72℃延神1min，30个循环；72C7min，保存于4℃C.
扩增产物在2.0%琼脂糖凝胶1XTAE缓冲液中电泳，EB染色后凝胶成像，分析是否出现目标片段大小的单带.
6签定特征
6.1培养性状
在PSA培养基平板上菌落突起，白色致密呈絮状，高3mm~5mm，菌落正面有同心轮纹，背面菌落呈紫色.在PDA培养基上，2d后出现白色菌丝，3d后开始产孢，7d后菌落呈圆形，边缘白色，向内逐渐变成粉红色，菌丝细绒状、蓬松，背面菌落呈紫色（参见附录D中图D.1）.
6.2形态特征
菌丝有隔，小型分生孢子居多，着生于单生瓶梗上，常在瓶梗顶端处聚成假头状，无色，单孢，长椭圆形，椭圆形或卵形，无或有1个分隔，大小为（3.9μm~13.0μm）×（2.6μm~5.2pm）；大型分生孢子较 少，肇刀形或新月形、有脚胞.1个~4个分隔，多为3隔，大小为（13.0m~36.4pm）×（2.6gm~2
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5.2μm）.厚垣孢子间生或顶生，球形，大小为（5.2μm~13.00μm）×（5.2pμm~13.0pm）（参见附录D中图D.2）.草莓枯萎病菌与其近似种的区别参见附录E.
6.3PCR特异性产物
引物FofraF/FofraR特异性 PCR扩增片段为 239 bp.
7结果判定
病原菌培养性状符合6.1中描述形态特征符合6.2中描述，PCR特异性扩增片段符合6.3中描述可鉴定为草莓枯萎病菌.
8样品保存
8.1样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存.对检出草莓枯萎病菌的样品应保存于4C冰箱中，以备复核.该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理.
8.2菌株保存与处理
从检测样品中分离并鉴定为草莓枯萎病菌的菌株，应妥善保存.将菌株接种于PSA培养基斜面时用病菌分生孢子作冻干菌种保存.保存期满后高压灭活处理. 上，存活后置于4℃～8C黑暗条件下保存，定期（3个月）转接，以防止病菌死亡，至少保存6个月，必要
8.3结果记录与资料保存
实验记录包括样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并有实验人员和审核人员签字.
