中华人民共和国国家标准
GB/T 36778-2018
Detectionandidentification of Oatmosaicvirus
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、浙江省农业科学院、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：郭立新、段维军、梁新苗、杨永生、孙丽英、吴薇、荣德福.
燕麦花叶病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了燕麦花叶病毒的血清学、分子生物学及免疫电镜检测与鉴定方法.本标准适用于燕麦属（Aurna）植株、种子及种子中夹杂的土壤上的燕麦花叶病毒的检疫和鉴定.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法
3燕麦花叶病毒基本信息
异名：Soil-borne oat mosaic virus.分类地位：马铃薯Y病毒科（Poryiridae）、大麦黄花叶病毒属（Bymovirux）. 缩写：OMV.
学名：Oat mosaicvirus.
燕麦花叶病毒的其他信息参见附录A.
4方法原理
双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）、反转录聚合酵链式反应（RT-PCR）及免疫电镜（IEM）检测是本标准制定的主要依据.
5仪器设备和主要试剂
5.1仪器设备
电子天平（感量0.001g）、普通天平（感量0.1g）、高速冷冻离心机、小型离心机、超低湿冰箱（一80C）、制冰机、旋涡振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、超净工作台、PCR仪、电泳仪、电泳植、凝胶分析成像系统、酶标仪、洗板机、透射电子显微镜.
5.2主要试剂
试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定.DAS-ELISA检测试剂见附录B；RT-PCR检测试剂见附录C：IEM检测试剂见SN/T 1840
6检测样品制备
6.1种子
抽样按照SN/T2122的规定执行.
子泡软后（约12h~24h）进行试验. 挑取至少1000粒种子样品，将其分成若干份，每份25粒～100粒.用灭菌蒸馏水浸泡种子，待种
6.2植株
抽样按照SN/T2122的规定执行.
分组（10株为1组）并编号检测，检测时选取幼嫩叶片进行试验. 对于有症状的植株样品编号单独检测，检测时选取全部表现症状的叶片.未表现症状的植株样品
7检测与鉴定
7.1DAS-ELISA 方法
止边际效应的发生，影响检验结果的准确性.在一次血清学检测试验中，一般设置2个阳性对照孔、2 DAS-ELISA检测时.将使用的点样孔安排在酶联板内部，避免使用酶联板周时一图的点样孔，防个阴性对照孔、2个空白对照孔作为质量控制，并根据送检样品数量设置待检样品孔数量，要求每个待检样品设置两次重复.
具体检测方法见附录B.
7.2一步RT-PCR方法
RT-PCR检测时，每个样品设置两个平行反应，检测时以感染燕麦花叶病毒的植物组织作为阳性对照，以健康植物组织作为阴性对照，以双蒸水代替模板作为空白对照.
具体检测方法见附录C.
7.3IEM检测方法
利用燕麦花叶病毒抗血清富集植物材料中的病毒，在透视电子显微镜下观察病毒颗粒的形态特征，具体检测方法见SN/T1840.如观察到长600nm~750nm，宽12nm~14nm弯曲线状的病毒粒子，即可判定IEM检测结果阳性.
8结果判定
若样品经酶联免疫检测结果为阳性，且RT-PCR检测为阳性或IEM检测为阳性，则判定为检出燕麦花叶病毒.
若样品经RT-PCR检测为阳性，且序列测定结果与已知燕麦花叶病毒核昔酸序列一致性不低于80%，则判定为检出燕麦花叶病毒.
9样品、结果记录与资料保存
9.1样品保存与处理
经检验确定携带燕麦花叶病毒的样品经登记人和经手人签字后妥善保存1年，以备复核，种子保存在干燥条件下或4C冰箱内，病叶冷冻干燥后保存于一20C或一80℃冰箱内.保存期满后应经高压 蒸汽灭菌后方可处理.
9.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字.酶联免疫方法需有酶联反应的原始数据，RT-PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片 及序列测定结果，IEM检测需有电镜照片.
