中华人民共和国国家标准
GB/T 35271-2017
Detection and identification of Maize chlorotic dwarfvirus
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.
本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中国科学院海洋研究所、中华人民共和国福建出入境检验检疫局.
本标准主要起草人：吴兴海、郑媛、邓明俊、纪瑛、栗志平、张云霞、封立平、沈建国.
玉米褪绿矮缩病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了玉米褪绿矮缩病毒的检疫和鉴定方法.
本标准适用于进出境粮谷作物上玉米褪绿矮缩病毒的检疫和鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样SN/T2964植物病毒检测规范
3玉米褐绿矮缩病毒基本信息
异名：Ohio corn stunt agent.缩写：MCDV.分类地位：伴生虹豆花叶病毒科（Secoviridae）、水稻矮化病毒属（Waikaviras）.玉米褪绿矮缩病毒的其他信息参见附录A.
学名;Maize chlorotic duarf virus .
4方法原理
根据该病毒的生物学、免疫学和分子生物学特性，利用基于抗原抗体反应的双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）、反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、实时荧光RT-PCR及免疫电镜（IEM）进行 检测鉴定.
5仪器设备和主要试剂
5.1仪器设备
电子天平（感量0.001g）、普通天平（感量0.1g）、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超低温冰箱（一80℃）、旋涡振荡器、高压灭菌锅、pH计、超净工作台、PCR仪、荧光PCR仪、微波炉、电泳仪、电泳槽、凝胶分析成像系统、酶联检测仪、透射电子显微镜.
5.2用具
可调移液器（2.5μL、10μL20μL100μL、1000μL）及吸头、离心管、PCR管和研钵等.
5.3主要试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定.双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂见附录B；RT-PCR检测试剂见附录C；免疫电镜检测试剂见SN/T1840.
6检测与鉴定
6.1取样
对于有症状的样品选取表现症状的样品组织，对于无症状的样品抽样方法按照SN/T2122进行.
6.2双抗体夹心酶联免疫吸附测定
把0.5g~1.0g样品充分研磨或在液氮中研磨，按1：10比例加人样品提取缓冲液，转移到离心管中，8000r/min 离心5min，上清液作为DAS-EL1SA的检测提取缓冲液.
设置阴性对照、阳性对照和空白对照，具体操作过程见附录B.
注：提取液在3h内使用，否期保存于4C中
6.3RT-PCR检测
分别提取样品总RNA后，进行RT-PCR检测.
设置阴性对照（健康植物组织）、阳性对照（感染MCDV的植物组织）和空白对照（ddHO），具体操作过程见附录C.
6.4实时荧光RT-PCR检测
实时荧光RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同6.3，双蒸水作为空白对照.分别提取样品和对照的RNA后进行实时荧光PCR检测，具体操作见附录D.
6.5免疫电镜检测
按照SN/T1840中规定的方法制备样品和进行电镜观察病毒粒子形态.在免疫电镜下如观察到大小为28nm~30nm的二十面球体，即可判定结果阳性.
6.6测序
当PCR产物回收后进行测序.
7结果判定
当产生以下检测结果时，则判定为检出MCDV，否则判定为未检出MCDV：当酶联免疫检测、RT-PCR检测、实时荧光RT-PCR检测、免疫电镜检测中有两种及两种以上的检测结果呈阳性时，判定为检出玉米褪绿矮缩病毒：一当RT-PCR检测为阳性，且序列测定结果与已知的MCDV序列一致，判定为检出玉米褪绿缩病毒.
8样品保存
8.1样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后，未检出玉米褪绿矮缩病毒样品，应置于一80℃冰箱内妥善保存3个月.对于检出玉米褪绿矮缩病毒的样品至少保存6个月，或保存至索赔有效期满，以备复核.该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理.
8.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员免疫电镜检测应有电镜照片，实时荧光RT-PCR检测应有荧光曲线图谐，测序应有核酸序列信息材料. 和审核人员签字.酶联免疫方法应有酶联反应的原始数据，RT-PCR凝胶电泳检测应有电泳结果照片，
