中华人民共和国国家标准
GB/T 34796-2017
Quantification and purity analysis of nucleic acid concentration insolution-Ultravioletspectrophotometry
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口
本标准起草单位：中国测试技术研究院生物研究所、上海市计量测试技术研究院、中国测试技术研究院、四川中测生物科技有限公司.
本标准主要起草人：谭和平、周李华、许丽、刘刚、马丽侠、李妍、叶德萍、梁文、王智、丁敏、孙登峰.
水溶液中核酸的浓度和纯度 检测紫外分光光度法
1范围
本标准规定了使用紫外分光光度法检测水溶液中核酸的浓度和纯度的原理、样品制备及检测方法.本标准适用于水溶液中核酸的浓度和纯度检测，可对浓度在5ng/μL及以上的水溶液核酸样品定量检测和纯度分析.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 11165实验室pH计GB/T26813双光束紫外可见分光光度计JG646移液器检定规程
3缩略语
下列缩略语适用于本文件.DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid)RNA：核糖核酸（ribonucleic acid）
4原理
270nm之间.碱基与戌糖、磷酸形成核苷酸后其最大吸收峰不会改变，最大吸收波长约260nm，吸收低峰在230nm.在波长260nm处，1单位OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50jμg/mL、单链DNA及RNA为40μg/mL单链寡核苷酸为33μg/mL，利用此量和浓度关系，可用于计算核酸样品的浓度.
5试剂和材料
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
5.1DNA标准溶液
小牛胸腺DNA标准溶液.
5.2三羟甲基氨基甲烷缓冲液（1mol/LTris-HCIpH7.4）
称取121.1gTris置于1L烧杯中，加人800mL去离子水，充分搅拌溶解，用NaOH调节pH值，
GB/T 34796-2017
定容至1L，分装后在103kPa（1.05kg/cm²）高压蒸汽灭菌20min，室温保存，备用.
5.3EDTA(500 mmol/L 、pH 8.0)
称取186.1gNaEDTA2HO，置于1L烧杯中，加人约800mL的去离子水，充分搅拌，用NaOH调节pH至8.0（pH至8.0时，EDTA才能完全溶解），定容至1L，分装后在103kPa （1.05kg/cm²）高压蒸汽灭菌20min，室温保存，备用.
5.4TE缓冲液（10×TE BufferpH 7.4)
加人800mL去离子水，混合均匀，定容至1L，分装后在103kPa（1.05kg/cm²）高压蒸汽灭菌20min， 量取 100 mL 1 mol/L Tris-HCI(pH 7.4) 20 mL 500 mmol/L EDTA(pH 8.0)置于1 L 烧杯中 室温保存，备用.
6主要仪器、设备
6.1紫外分光光度计或核酸蛋白测定仪，应符合GB/T26813的要求.6.2漩涡器.6.3电子天平：精度分别为0.1mg、0.01mg.6.4pH计，0.1级，应符合GB/T11165的要求.6.5可调移液器：0.5μL~10pL、10pL~100μL、100μL~1 000μL，应符合 JJG646的要求.
7样品制备
将适量核酸样品溶解于无菌水或TE落液中，稀释至工作曲线范围内供测定.
8吸光度检测核酸浓度和纯度
8.1仪器设置条件和程序
8.1.1核酸浓度检测
检测波长：260nm.
8.1.2核酸纯度检测
检测波长：260nm230nm 280 nm.
8.2测定
280nm处核酸的吸光度，计算DNA双链、DNA单链和RNA的浓度，根据OD/OD和OD/ 取适量核酸溶液（溶液体积根据仪器要求）检测，以稀释溶液调零，根据波长260nm、230nm、OD比值判断核酸纯度，重复测定3次取平均值.核苷三磷酸的特性参见表A.1及纯化的DNA的分光光度测定结果参见表B.1.
8.3结果计算
8.3.1核酸浓度检测结果计算
核酸浓度按照以下公式计算：
a）核酸样品摩尔浓度含量按式（1）计算：
-(1 )
式中：
（-样品浓度，单位为摩尔每升（mol/L）：
A吸光度；
波长依赖的摩尔消光系数，单位为升每摩尔厘米[L/（molcm）]；
b一光程，单位为厘米（cm）.
b）样品的质量浓度按式（2）计算：
"( 2 )
式中：
p 样品浓度，单位为克每升（g/L）；OD B 平均消光系数[（μg/mL）-cm]. 光程为1cm时在260nm波长下的吸光度值，单位为每厘米（cm）；
注：对于大分子核酸来说其浓度计算时可采用平均消光系数.对于较小的察核苷酸，可根据式（3）由碱基组成精确计算出摩尔消光系数.再根据式（21计算寡核苷酸浓度.
E 毫摩尔消光系数（寡核昔酸的浓度一般以mmol/L表示）；AG、C、T -赛核苷酸序列中每个核苷酸的个数.
式中：
8.3.2核酸纯度检测结果判断
样品纯度根据式（4）、式（5）计算，按照表1进行判断：
.( 4)
(5)
表1吸光度法检测核酸纯度结果判断表
检测结果样品类型 X值 Y值DNA 样品 纯DNA理论值为大于2.0.表明有 小于1.6，表明有蛋 小于2表明有酚盐、硫氰酸盐或1.8 大于2.0.表明有异 RNA污染 白质污染 其他有机化合物污染RNA样品 纯RNA理论值为 2.0 硫氰酸残存 小于1.7，表明有蛋 白质污染 小于2表明有酚盐、硫氰酸盐或 其他有机化合物污染
9扫描吸收光谱检测核酸浓度和纯度
9.1仪器设置条件和程序
检测波长：220nm~340nm范围内全波长扫描，并设置报告260nm值、280nm值、ODs/ODOD/OD比值
