中华人民共和国国家标准
GB/T35535-2017
大豆、油菜中外源基因成分的测定 膜芯片法
Detection of genetically modified ponents in soybean and canolaMembrane-based gene-chip method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口.
本标准起草单位：国家农业标准化监测与研究中心（黑龙江）、四川华汉三创生物科技有限公司、安微省食品药品检验研究院、上海泽衡生物科技有限公司.
本标准主要起草人：彭丽萍、黄广平、姜雯、陈潇、王志强、曾莲、孔鲁裔、周均、郭尚、王海宽、谢长江、徐风霞、李新利.
大豆、油菜中外源基因成分的测定 膜芯片法
1范围
本标准规定了膜芯片法检测大豆、油菜中外源基因成分的防污染措施、抽样与制样、原理、试剂与标准品、仪器与设备、试验方法和流程、结果判断、确证实验、结果表述.
本标准适用于大豆、油菜中外源基因成分的定性检测.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法SN/T1204植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法
3缩略语
下列缩略语适用于本文件.
AminolinkerC6：6个碳原子作为连接臂的氨基标记（C6Aminolinker）
BAR：草丁瞬乙酰转移酶基因（phosphinothricin acetylatransferase gene)
BARNASE;来源于解淀粉芽孢杆菌（Bacilus am ylolique faciens）的编码核糖核酸酶的基因(Baciffus am yfolique faciens ribonuclease gene)
BARSTAR：来源于解淀粉芽孢杆菌（Baciluxαmyloliquefaciens）的编码核糖核酸酶抑制物的基因(inhibitor of Bacilus a ylolique faciens ribonuclease gene)
virus) CaMV35S-T：来自于花椰菜花叶病毒的 35S终止子（35S terminator fromcauliflower mosaic
CrylAc:苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白 cry1A（c）基因[Bacillas rhuringiensis Inseeticidal toxincry1 A(c) gene]
dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine triphosphate)
dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidine triphosphate)
dGTP：脱氧乌苷三磷酸（deoxyguanosine triphosphate)
dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidine triphosphate）
GB/T 35535-2017
dUTP：脱氧尿苷三磷酸（deoxyuridine triphosphate)
EPSPS：5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因（5-enolpyruvy1-shikimate-3-phosphate synthasegene)FMV35S-P:玄参花叶病毒35S启动子（35S promoter from figwort mosaic virus)GAT4601：草甘麟乙酰转移酶基因(glyphosate acetyltransferase gene）GOX：草甘腾氧化还原酶基因(glyphosate oxidoreductase gene)Lectin：凝集素基因（lectin gene) NC:阴性对照(Negative control)NOS-3：胭脂碱合成酶基因终止子（terminator of the nopaline synthase gene)NPT-II ：新霉素-3-磷酸转移酶基因(neomycin phosphotransferase gene)PAT：草丁麟乙酰CoA转移酶基因(phosphinothricin acetyltransferase gene)PC：阳性对照(Positive control) PEP:磷酸烯醇式丙酮酸双化酶基因(phosphoenolpyruvate carboxylase gene)Taq: Thermus Aquaficas DNA 聚合B ( Thermus Aquaticus DNA polymerase)UDG酶：尿喀啶-N-糖基化酶（Uracil N-glycocasylase)
4防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施应按照GB/T19495.2的规定执行.
5抽样与制样
应符合GB/T19495.7的相关规定.
6原理
待检样品经DNA模板提取和核酸定量，采用多重PCR扩增体系，扩增其中可能含有的转基因大豆、油菜中常见外源基因特异性扩增序列，PCR扩增产物与固定有目标外源基因特异性探针的膜芯片进行杂交后，检测结果可以用肉眼直接判断，或用芯片识读仪对杂交芯片进行扫描并判定结果.
7试剂与标准品
7.1总则
除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T6682三级水的规定.
7.2试剂组分
本标准中试剂组分和存放条件参见附录A和7.3～7.5的规定.
7.3引物
规定. 大豆PCR反应使用的引物序列应符合表1的规定、油菜PCR反应使用的引物序列应符合表2的
表1大豆PCR反应使用的引物序列
目标基因 引物名称 序列 扩增片段大小bpEPSPS Forward 5′-GCGCGATCATACGGAAAAGAT-3′ 5′-biotin-TCGATGACTTGGCCGGTGAG-3′ 123Forward Reverse 5′-AGAAACAGTACCAGCTCCGA-3′GAT4601 Reverse 5′-biotin-TAGCCTGAGGCGGATGTCCTC-3′ 151Forward 5′-TACTGCAACACTCGAGGCTG-3′Cry1Ac Revese 5′-biotin-TTTCTCGGACAATTCTCGCT-3′ 190Forward 5′-TGATATGGCCGCGGTTTGTGAT-3′ 180PAT Reverse 5′-biotin-GGCCCAGCGTAAGCAATACC-3′FMV35S-P Forward 5′-AGTCCAAAGCCTCAACAAGG-3' 168Reverse 5′-biotin-CCCACTAACTTTAAGTCTTCGGTG-3′CaMV35S-P Forward Revetse 5′-GAAGATGCCTCTGCCGACAG-3′ 5′-biotin-ATCAATCCACTTGCTTTGAAGACG-3 106Forward 5′-CCAGATAAGGGAATTAGGGTTC-3′CaMV35S-T Reverse 5′-biotin-ACTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGA-3′ 132Forward 5′-CCTGTTGCCGGTCTTGCGAT-3′NOS-3 Revers 5′-biotin-TTTATCCTAGTTTGCGCGCT-3′ 177Forward 5′-AAGTTGAAAACCCAGAATGTGG-3′ 134Lectin Revetse 5'′-biotin-TTTGGTTGCTTCGGCACGAA-3
表2油菜PCR反应使用的引物序列
目标基因 引物名称 序列 扩增片段大小bpEPSPS Forward Revetse 5′-GTCCGTATTCCAGGTGACAA-3′ 5′-biotin-TTCCTTACGGATTCTGGCAC-3" 156Forward 5′-ACTGGAAGCGTGCTCACGTT-3′GOX Reverse 5′-biotin-ACCAGTCATACCGAGGTGAC-3′ 200Forward 5′-ACAGTGAACTTTAGGACAGAGC-3PAT Reverss 5′-biotin-AGCGTAAGCAATACCAGCCA-3' 126NPT-1I Forward 5′-GCAGGATCTCCTGTCATCTC-3 190Reverse 5′'-biotin-ATGCTCTTCGTCCAGATCAT-3′BAR Forward 5′-CGTCTGCGGGAGCGCTATCC-3′ 168Reverst 5′-biotin-GTAGAGCGTGGAGCCCAGTC-3BARNASE Forward Reverse 5′-GGATTTCCGTTTGTTTACTGGTGC-3′ 5′-biotin-TGTCTGAAGATAATCCGCAACC-3′ 146
